La mionectina protege contra la disfunción del músculo esquelético en ratones macho mediante la activación de la vía AMPK/PGC1α
Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4675 (2023) Citar este artículo
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Mantener y restaurar la masa y la función del músculo esquelético es esencial para un envejecimiento saludable. Hemos descubierto que la mionectina actúa como una mioquina cardioprotectora. Aquí, investigamos el efecto de la mionectina sobre la atrofia del músculo esquelético en varios modelos de disfunción muscular en ratones macho. La alteración de la mionectina exacerba la atrofia del músculo esquelético en modelos de atrofia muscular asociada a la edad, inducida por denervación ciática o inducida por dexametasona (DEX). La deficiencia de mionectina también contribuye a una disfunción mitocondrial exacerbada y reduce la expresión de genes asociados a la biogénesis mitocondrial, incluido PGC1α, en el músculo denervado. La suplementación con mionectina atenúa la atrofia muscular inducida por la denervación mediante la activación de AMPK. Myonectin también revierte la atrofia de miotubos cultivados inducida por DEX a través de la señalización AMPK/PGC1α. Además, el tratamiento con mionectina suprime la atrofia muscular en el modelo de ratón propenso a la senescencia acelerada (SAMP) 8 de envejecimiento acelerado o en el modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne. Estos datos indican que la mionectina puede mejorar la disfunción del músculo esquelético a través de mecanismos dependientes de AMPK/PGC1α, lo que sugiere que la mionectina podría representar un objetivo terapéutico de la atrofia muscular.
La discrepancia entre la esperanza de vida media y la esperanza de vida saludable es un problema social grave en las sociedades envejecidas de todo el mundo. La pérdida de masa y función muscular asociada a la edad, también conocida como sarcopenia, es uno de los factores determinantes de la discapacidad física, lo que conduce a resultados adversos que incluyen mala calidad de vida y muerte1. El entrenamiento físico da como resultado una mejora de la masa y la función muscular y proporciona un beneficio para la sarcopenia. Sin embargo, las discapacidades causadas por complicaciones asociadas a la edad, como accidentes cerebrovasculares, fracturas óseas y caquexia asociada al cáncer, hacen que el entrenamiento físico sea poco práctico o ineficaz entre los pacientes de edad avanzada. Por tanto, el desarrollo de enfoques terapéuticos para mantener y restaurar la masa y la función del músculo esquelético podría ser indispensable para un envejecimiento saludable.
La mionectina, también conocida como proteína 15 relacionada con C1q/TNF/eritroferrona, actúa como un factor secretado derivado del músculo, también conocido como miocina, que se expresa abundantemente en el tejido del músculo esquelético2,3. Se ha informado que la mionectina modula el metabolismo de los ácidos grasos, el metabolismo del hierro, la diferenciación de osteoblastos y osteoclastos y la adipogénesis4,5,6,7,8. Recientemente hemos informado que la mionectina es una miocina inducida por el ejercicio que protege al corazón de la lesión por isquemia-reperfusión9. Estos hallazgos indicaron que la mionectina afecta a órganos cercanos o remotos de forma endocrina para mantener la homeostasis de todo el cuerpo. Sin embargo, no se ha aclarado el impacto de la mionectina sobre la función y la enfermedad del músculo esquelético de forma autocrina. Aquí, investigamos si la mionectina modula la función del músculo esquelético en varios modelos de disfunción muscular en ratones, incluida la sarcopenia relacionada con la edad.
Investigamos si la expresión de mionectina muscular está modulada por el proceso de envejecimiento. Los niveles de ARNm y proteína de mionectina (Fam132b) en los tejidos musculares sóleo y gastrocnemio fueron significativamente más bajos en ratones WT de 80 semanas (envejecidos) que en ratones WT de 20 semanas (jóvenes) (Fig. 1a y Fig. Suplementaria. 1). Para investigar si la mionectina contribuye a la masa y función del músculo esquelético en ratones de edad avanzada, se evaluó el peso y la fuerza muscular en ratones knockout para mionectina (KO) jóvenes y ancianos. Los pesos de los tejidos musculares de gastrocnemio y sóleo divididos por el peso corporal fueron significativamente menores en ratones con mionectina-KO envejecidos que en ratones WT envejecidos, mientras que no hubo diferencias significativas en los pesos de los músculos entre ratones WT jóvenes y ratones jóvenes con mionectina-KO (Fig. 1b). . Los ratones con mionectina-KO envejecidos exhibieron un mayor peso corporal en comparación con los ratones WT envejecidos, mientras que el peso corporal no difirió entre los ratones jóvenes WT y los ratones jóvenes con mionectina-KO (Figura complementaria 2a). El peso del músculo gastrocnemio fue significativamente menor en ratones mionectina-KO envejecidos que en ratones WT envejecidos (Figura complementaria 2a). El peso del músculo sóleo parecía ser menor en ratones mionectina-KO de edad avanzada que en ratones WT de edad avanzada, pero esto no fue estadísticamente significativo. No hubo diferencias significativas en el peso del músculo gastrocnemio y del músculo sóleo entre ratones jóvenes WT y jóvenes mionectina-KO.
a Los niveles de ARNm de mionectina (Fam132b) en los músculos sóleo (N = 9 en cada grupo) y gastrocnemio (N = 10 en cada grupo) de ratones WT jóvenes de 20 semanas y de 80 semanas de edad. b – e La masa y la fuerza muscular se evaluaron en ratones WT jóvenes de 20 semanas de edad, ratones jóvenes con mionectina-KO de 20 semanas de edad, ratones WT de 80 semanas de edad y ratones con mionectina-KO de 80 semanas de edad. b Se muestra la relación entre el peso del músculo gastrocnemio o sóleo y el peso corporal. N = 6 en cada grupo. c Los paneles de la izquierda muestran imágenes transversales representativas del músculo gastrocnemio. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles de la derecha muestran la cuantificación del área de sección transversal media (CSA) y la distribución de CSA. N = 6 en cada grupo. d Se muestra la fuerza de agarre máxima en 4 extremidades o en 2 extremidades anteriores, normalizada por el peso corporal. N = 6 en cada grupo. e Número medio de rotaciones por día medido mediante prueba voluntaria de funcionamiento de ruedas. N = 6 en cada grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM. Prueba t de Student impar de dos colas para a. Se realizó ANOVA unidireccional con un análisis post hoc para b – e. Gastroc. músculo gastrocnemio, peso corporal BW.
Consistentemente, el área transversal media (CSA) de los tejidos del músculo gastrocnemio fue significativamente menor en ratones con mionectina-KO de edad avanzada que en los ratones WT de edad avanzada, mientras que no hubo diferencias en el CSA de los tejidos del músculo gastrocnemio entre ratones WT jóvenes y ratones jóvenes con mionectina-KO ( Figura 1c). Consistentemente, los ratones myonectina-KO envejecidos mostraron una distribución de tamaño más pequeña del CSA del músculo gastrocnemio en comparación con los ratones WT envejecidos (Fig. 1c). Además, la CSA media de las fibras musculares tipo II en el músculo gastrocnemio fue significativamente menor en ratones mionectina-KO de edad avanzada que en ratones WT de edad avanzada (Figuras complementarias 3a, b). No hubo diferencias en la CSA media de las fibras musculares tipo I en el músculo gastrocnemio entre ratones WT y mionectina-KO envejecidos (Figuras complementarias 3a, b). Los ratones mionectina-KO envejecidos exhibieron una mayor frecuencia de CSA de fibra tipo II más pequeña en comparación con los ratones WT envejecidos, mientras que la distribución del área de la sección transversal de la fibra tipo I no difirió entre los ratones WT y mionectina-KO envejecidos (Figura complementaria 3b) . Los ratones WT envejecidos tenían una mayor frecuencia de fibras tipo I en el músculo gastrocnemio en comparación con los ratones WT jóvenes, y los ratones mionectina-KO envejecidos exhibieron una frecuencia reducida de fibras tipo I en comparación con los ratones WT envejecidos (Figura complementaria 3c).
Además, los ratones myonectina-KO envejecidos mostraron una reducción significativa de la fuerza máxima de agarre en 4 extremidades y en las 2 extremidades anteriores, que se normalizó por el peso corporal, en comparación con los ratones WT envejecidos (Fig. 1d). Los ratones mionectina-KO envejecidos también tuvieron una reducción significativa de la fuerza máxima no normalizada de agarre en 4 extremidades en comparación con los ratones WT envejecidos (Figura complementaria 2b). La fuerza máxima no normalizada de la fuerza de agarre en las 2 extremidades anteriores parecía ser menor en ratones myonectina-KO de edad avanzada que en ratones WT de edad avanzada, pero esto no fue estadísticamente significativo. La fuerza máxima de agarre en 4 extremidades y 2 extremidades delanteras, que se normalizó por el peso muscular, no difirió entre ratones WT y mionectina-KO envejecidos. No hubo diferencias significativas en la fuerza máxima de agarre en 4 extremidades y en 2 extremidades anteriores, que no estaba normalizada o normalizada por el peso corporal o el peso muscular, entre ratones jóvenes WT y jóvenes con mionectina-KO. En la prueba de carrera voluntaria con ruedas, los ratones myonectin-KO envejecidos mostraron una reducción notable del número promedio de rotaciones en comparación con los ratones WT envejecidos (Fig. 1e). Por tanto, la reducción de mionectina podría promover la atrofia y disfunción muscular en ratones de edad avanzada.
Para investigar más a fondo las funciones de la mionectina en la atrofia muscular, se sometió a ratones myonectina-KO y WT a atrofia muscular inducida por denervación o dexametasona (DEX). Los niveles de proteína mionectina en los tejidos del músculo gastrocnemio se redujeron significativamente en ratones WT operados con denervación y tratados con DEX en comparación con ratones WT simulados (Figura complementaria 4a). Cinco días después de la denervación del nervio ciático, los pesos de los tejidos musculares del gastrocnemio y del sóleo denervados normalizados por el peso corporal fueron significativamente menores en ratones mionectina-KO que en ratones WT (Fig. 2a). No hubo diferencias significativas en el peso corporal, el peso del músculo gastrocnemio denervado y el peso del músculo sóleo denervado entre ratones WT y mionectina-KO (Figura complementaria 2c). No hubo diferencias significativas en los pesos de los tejidos musculares del gastrocnemio y del sóleo no denervados, que no estaban normalizados o normalizados por los pesos corporales entre ratones WT y mionectina-KO (Fig. 2a y Fig. Suplementaria 2c).
a, b Ratones WT y mionectina-KO a la edad de 8 a 10 semanas fueron sometidos a una operación de atrofia muscular inducida por denervación ciática. Cinco días después de la denervación del nervio ciático, se utilizaron para los análisis los músculos denervados y no denervados (contralaterales). Se muestra la relación peso muscular/peso corporal de gastrocnemio (n = 11 ratones por grupo) o sóleo (N = 6 en ratones WT no denervados, KO no denervados y WT denervados, N = 5 en ratones KO denervados). b Los paneles de la izquierda muestran imágenes transversales representativas de las fibras musculares del gastrocnemio. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos del área de sección transversal media (CSA) y la distribución de CSA del músculo gastrocnemio. N = 5 en cada grupo. c, d 14 días después de la administración continua de dexametasona (DEX) o vehículo (Sham), se sacrificaron ratones WT y mionectina-KO para su análisis. c Se muestra la relación entre el peso del músculo gastrocnemio o sóleo y el peso corporal. N = 5 en cada grupo. d Los paneles de la izquierda muestran imágenes transversales representativas de las fibras del músculo gastrocnemio. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos de la CSA media y la distribución de CSA del músculo gastrocnemio. N = 5 en cada grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se realizó ANOVA unidireccional con un análisis post hoc para a – d. Gastroc. músculo gastrocnemio, peso corporal BW, DEX dexametasona.
La CSA media de los tejidos musculares del gastrocnemio y el sóleo denervados fue significativamente menor en los ratones con mionectina-KO que en los ratones WT, mientras que no hubo diferencias en la CSA de los músculos del gastrocnemio y el sóleo no denervados entre los ratones WT y con mionectina-KO (Fig. 2b y Suplementario). Figura 4b). Los ratones Myonectin-KO tuvieron la distribución de tamaño más pequeña de CSA del músculo gastrocnemio y sóleo denervado en comparación con los ratones WT (Fig. 2b, Fig. Suplementaria 4b).
La CSA media de las fibras musculares tipo II en los músculos gastrocnemio y sóleo denervados fue significativamente menor en ratones mionectina-KO que en ratones WT, mientras que no se observaron diferencias en la CSA media de las fibras musculares tipo I en músculos denervados entre ratones WT y mionectina-KO ( Figuras complementarias 5a, by 6a, b). Los ratones mionectina-KO mostraron una mayor frecuencia de CSA de fibra tipo II más pequeña del músculo gastrocnemio y sóleo denervados en comparación con los ratones WT, mientras que la distribución de CSA de fibra tipo I en el músculo denervado no difirió entre ratones WT y mionectina-KO (Figs. 5b y 6b). No hubo diferencias en las frecuencias de las fibras tipo I en el músculo gastrocnemio y sóleo después de la denervación entre ratones WT y mionectina-KO (Figuras complementarias 5c y 6c). Se observó poca fibrosis en el músculo gastrocnemio denervado o no denervado en ratones WT y mionectina-KO, y no se observaron diferencias en el área de fibrosis intersticial entre ratones WT y mionectina-KO (Figura complementaria 7).
Además, 14 días después de la administración continua de DEX, los pesos de los tejidos musculares del gastrocnemio y el sóleo se normalizaron con respecto al peso corporal en comparación con los ratones WT (Fig. 2c). El peso corporal no difirió entre los ratones WT y mionectina-KO tratados con DEX (Figura complementaria 2d). Los pesos de los tejidos musculares de gastrocnemio y sóleo parecían ser menores en ratones con mionectina-KO tratados con DEX que en ratones WT tratados con DEX, pero esto no fue estadísticamente significativo. No hubo diferencias significativas en el peso corporal, el peso del músculo gastrocnemio y el peso del músculo sóleo entre los ratones WT y mionectina-KO tratados de forma simulada (Figura complementaria 2d).
La CSA media del músculo gastrocnemio se redujo significativamente en ratones mionectina-KO después del tratamiento con DEX en comparación con los ratones WT (Fig. 2d). Los ratones Myonectin-KO tuvieron la distribución de tamaño más pequeña de CSA del músculo gastrocnemio después del tratamiento con DEX en comparación con los ratones WT (Fig. 2d). La CSA media de las fibras musculares tipo II en el músculo gastrocnemio fue significativamente menor en ratones mionectina-KO tratados con DEX que en los ratones WT tratados con DEX, mientras que no hubo diferencias en la CSA media de las fibras musculares tipo I entre ratones WT tratados con DEX y DEX. Ratones mionectina-KO tratados (Figuras complementarias 8a, b). La mayor frecuencia de CSA de fibra tipo II más pequeña del músculo gastrocnemio se observó en ratones mionectina-KO tratados con DEX en comparación con ratones WT tratados con DEX, mientras que la distribución de CSA de fibra tipo I en el músculo gastrocnemio no difirió entre WT tratados con DEX y Ratones mionectina-KO tratados con DEX (Figura complementaria 8b). No hay diferencias en los porcentajes de fibras tipo I en el músculo gastrocnemio después del tratamiento con DEX entre ratones WT y mionectina-KO (Figura complementaria 8c).
La fuerza máxima de agarre en 4 extremidades y en las 2 extremidades anteriores, que no estaba normalizada o normalizada por el peso corporal, se redujo significativamente en ratones mionectina-KO tratados con DEX en comparación con ratones WT tratados con DEX (Figura complementaria 2e). La fuerza máxima de agarre en 4 extremidades, pero no en las 2 extremidades anteriores, que se normalizó por el peso muscular, se redujo significativamente en ratones mionectina-KO tratados con DEX en comparación con ratones WT tratados con DEX. Estos resultados indican que la mionectina podría modular la atrofia del músculo esquelético en respuesta a múltiples estímulos patológicos.
Para examinar el mecanismo molecular por el cual la deficiencia de mionectina promueve la atrofia muscular, analizamos exhaustivamente la expresión de ARNm en gastrocnemios desnervados de ratones WT y mionectina-KO mediante RNA-Seq. El análisis diferencial de la expresión génica con un valor p ajustado por FDR <0,05 y un cambio absoluto de log2 > 0,5 identificó 1.399 genes regulados positivamente y 573 regulados negativamente en ratones mionectina-KO en comparación con ratones WT (Fig. 3a). El análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) reveló que los cambios en los genes dependientes de mionectina estaban asociados con la vía en el cáncer, los proteoglicanos en el cáncer, la adhesión focal, la vía de señalización de las adipocitoquinas, la vía de señalización de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y la señalización de Apelina. vía (Fig. 3a). Entre estos conjuntos de genes regulados diferencialmente, se sabe que la vía de señalización AMPK regula la función del músculo esquelético. Debido a que PGC1α es un objetivo crucial de AMPK que previene la disfunción muscular en modelos de atrofia muscular10,11,12,13, los niveles de expresión de PGC1α se evalúan en el músculo gastrocnemio denervado y no denervado de ratones WT y mionectina-KO mediante métodos cuantitativos en tiempo real. Métodos de PCR. Los niveles de ARNm de Pgc1α en los músculos gastrocnemios denervados se redujeron significativamente en ratones mionectina-KO en comparación con los ratones WT (Fig. 3b). En particular, los niveles de expresión de Pgc1α4, que se relaciona específicamente con la hipertrofia muscular, también se regularon negativamente en ratones mionectina-KO en comparación con los ratones WT (Fig. 3b). Asimismo, los niveles de proteína de PGC1α y PGC1α4 en el músculo gastrocnemio denervado se redujeron en ratones mionectina-KO en comparación con los ratones WT (Fig. 3c). Además, los niveles de fosforilación de AMPK se redujeron en el músculo gastrocnemio denervado en ratones mionectina-KO en comparación con ratones WT (Fig. 3c). Además, los niveles de proteína del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1), que está regulado positivamente por PGC1α414, se redujeron en el músculo gastrocnemio desnervado en ratones mionectina-KO en comparación con ratones WT (Fig. 3c). Por el contrario, los niveles de expresión de genes relacionados con la ubiquitina ligasa, incluida la proteína F-box only (Fbxo) 32 y el motivo tripartito que contiene (Trim) 63, la miostatina (Mstn) y los genes miogénicos, incluidos Myod1 y Myog, en músculos desnervados, no fueron diferentes entre WT. y ratones mionectina-KO (Fig. 3d). Estos resultados indican que la deficiencia de mionectina podría exacerbar la atrofia muscular debido a la regulación negativa de las vías AMPK/PGC1α.
Se sometieron ratones a – d WT y mionectina-KO a la edad de 8 a 10 semanas a una operación de atrofia muscular inducida por denervación ciática. Cinco días después de la denervación del nervio ciático, se utilizaron para los análisis los músculos gastrocnemios denervados y no denervados (contralaterales). a Los cambios en la expresión génica en el músculo gastrocnemio desnervado entre ratones WT y mionectina-KO se evalúan mediante RNA-seq. El panel izquierdo muestra gráficos MA de genes regulados diferencialmente entre ratones mionectina-KO y WT. El eje x representa los recuentos medios normalizados y el eje y muestra el cambio de log2. Los gráficos rojos muestran genes significativamente regulados con un valor de p ajustado por FDR < 0,05 y un cambio absoluto de log2 > 0,5. El panel derecho muestra el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG para genes regulados de manera significativamente diferencial. N = 4 en cada grupo. b Los niveles de ARNm de Pgc1α y Pgc1α4 se evalúan mediante análisis de PCR cuantitativo. N = 6 en ratones WT denervados y no denervados. N = 5 en ratones KO denervados y no denervados. c Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de pAMPK, AMPK, PGC1α, PGC1α4, IGF1 y tubulina. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos de las señales de PGC1α, PGC1α4, pAMPK e IGF1 normalizadas a la señal de tubulina. N = 5 en cada grupo. d Los niveles de ARNm de la ubiquitina ligasa y los genes miogénicos. N = 6 en ratones WT denervados y no denervados. N = 5 en ratones KO denervados y no denervados. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se realizó ANOVA unidireccional con un análisis post hoc para b – d.
Debido a que PGC1α es un regulador clave de la biogénesis mitocondrial10, investigamos si la deficiencia de mionectina contribuye a la disfunción mitocondrial en respuesta a la atrofia muscular. Los niveles de expresión de genes relacionados con la biogénesis mitocondrial, incluidos Tfam, Sirt1, Nrf1 y Nfe2l2 en músculo desnervado, fueron significativamente más bajos en ratones mionectina-KO en comparación con ratones WT (Fig. 4a).
Se sometieron ratones a – d WT y mionectina-KO a la edad de 8 a 10 semanas a una operación de atrofia muscular inducida por denervación ciática. Cinco días después de la denervación del nervio ciático, se utilizaron para los análisis los músculos gastrocnemios denervados y no denervados. a Los niveles de ARNm de genes relacionados con la biogénesis mitocondrial se evaluaron mediante el método de PCR cuantitativa en tiempo real. N = 6 en ratones WT denervados y no denervados. N = 5 en ratones KO denervados y no denervados. b Los paneles superiores muestran micrografías electrónicas representativas de los músculos gastrocnemios. La flecha muestra mitocondrias alteradas. Las mitocondrias alteradas se definen como mitocondrias que tienen una separación parcial o completa de las membranas externa e interna e hinchazón. Los paneles inferiores muestran la cuantificación del número de mitocondrias intramiofibrilares y el porcentaje de mitocondrias alteradas. N = 5 en cada grupo. Las barras de escala muestran 1 μm en X15 000 y 400 nm en X50 000. c Se midió la actividad relativa de la citrato sintasa en una fracción mitocondrial aislada de músculos gastrocnemios desnervados. N = 6 en ratones WT denervados y no denervados. N = 5 en ratones KO denervados y no denervados. d El panel izquierdo muestra análisis de transferencia Western representativos de complejos de fosforilación oxidativa. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos de las señales del complejo I y del complejo II. N = 5 en cada grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se realizaron ANOVA unidireccional (a, b) con un análisis post-hoc y prueba t de Student no pareada de dos colas (c, d).
También evaluamos el cambio morfológico de las mitocondrias durante el proceso de atrofia muscular mediante microscopía electrónica de transmisión. La cantidad de mitocondrias en los tejidos musculares desnervados fue significativamente menor en ratones mionectina-KO que en ratones WT (Fig. 4b). Además, el porcentaje de mitocondrias alteradas, que muestra disfunción mitocondrial, en tejidos musculares denervados fue significativamente mayor en ratones mionectina-KO que en ratones WT (Fig. 4b). Consistentemente, la actividad de la citrato sintasa, que es un marcador de la función mitocondrial intacta, en la fracción mitocondrial aislada del músculo gastrocnemio fue menor en ratones mionectina-KO que en ratones WT (Fig. 4c). Además, la expresión del complejo mitocondrial I y del complejo II en la fracción mitocondrial aislada del músculo gastrocnemio fue menor en ratones mionectina-KO que en ratones WT (Fig. 4d). Así, la mionectina podría ejercer una función protectora contra la disfunción mitocondrial inducida por la atrofia muscular.
Para analizar el mecanismo preciso por el cual la mionectina previene la atrofia muscular, se utilizaron miotubos C2C12 para el análisis. Evaluamos el efecto de la mionectina sobre la atrofia de miotubos inducida por DEX. El tratamiento con proteína mionectina restableció la reducción del diámetro de los miotubos inducida por DEX (Fig. 5a). El tratamiento de miotubos C2C12 con mionectina aumentó los niveles de expresión de PGC1α, PGC1α4 e IGF1 en presencia o ausencia de DEX (Fig. 5b). Además, el tratamiento de miotubos C2C12 con proteína mionectina aumentó de forma dependiente del tiempo los niveles de expresión de PGC1α y los niveles de fosforilación de AMPK y acetil CoA carboxilasa (ACC) (Fig. 5c). Para aclarar si los efectos de la mionectina estaban mediados por la vía dependiente de AMPK/PGC1α, se transdujeron miotubos C2C12 con vectores adenovirales que expresaban un mutante dominante negativo de AMPK (Ad-dnAMPK) o β-galactosidasa de control (Ad-β-gal). La transducción de miotubos C2C12 con Ad-dnAMPK suprimió la fosforilación de ACC estimulada por mionectina, que es una señal descendente de AMPK (Fig. 5d). La transducción con Ad-dnAMPK disminuyó la expresión de PGC1α mejorada con mionectina en miotubos C2C12 (Fig. 5d). Es de destacar que el tratamiento con Ad-dnAMPK revirtió el aumento inducido por mionectina en el diámetro de los miotubos en presencia de DEX (Fig. 5e).
a, b Los miotubos C2C12 se trataron previamente con proteína mionectina (5 µg/ml) o vehículo durante 1 hora, seguido de estimulación con DEX (100 µM) o vehículo durante 24 horas. a Los paneles superiores muestran imágenes representativas de miotubos. Las barras de escala muestran 200 μm. El panel inferior muestra la cuantificación del diámetro del miotubo. N = 5 en cada grupo. b Los paneles superiores muestran análisis de transferencia Western representativos de PGC1α, PGC1α4, IGF1 y tubulina. Los paneles inferiores muestran la cuantificación de las señales de PGC1α, PGC1α4 e IGF1 normalizadas a la señal de tubulina. N = 4 en cada grupo. c Se trataron miotubos C2C12 con proteína mionectina (5 µg/ml) o vehículo durante los períodos de tiempo indicados. Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de pAMPK, AMPK, pACC, ACC, PGC1α y tubulina. Los gráficos de la derecha muestran análisis cuantitativos de las relaciones de señal pAMPK/tubulina, pACC/tubulina y PGC1α/tubulina. N = 4 en cada grupo. d, e Los miotubos C2C12 se trataron previamente con vectores adenovirales que expresan la forma mutante dominante negativa de AMPKα2 marcada por Myc (Ad-dnAMPK) o Ad-β-gal de control 24 horas antes del tratamiento con mionectina. d Se trataron miotubos C2C12 con proteína mionectina (5 µg/ml) o vehículo durante 1 hora. Los paneles de la izquierda muestran transferencias Western representativas de pACC, ACC, PGC1α, Myc-Tag y tubulina. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos de las relaciones de señal de pACC/tubulina y PGC1α/tubulina. N = 3 en cada grupo. Los miotubos C2C12 se trataron previamente con proteína mionectina (5 µg/ml) o vehículo durante 1 hora, seguido de estimulación con DEX (100 µM) o vehículo durante 24 horas. Los paneles superiores muestran imágenes representativas de miotubos. Las barras de escala muestran 200 μm. El panel inferior muestra la cuantificación del diámetro de los miotubos. N = 4 en cada grupo. f Se transdujeron miotubos C2C12 con ARNip dirigido a PGC1α o ARNip de control no relacionado 24 horas antes del tratamiento con mionectina. Los paneles superiores muestran imágenes representativas de miotubos. El panel inferior muestra la cuantificación del diámetro de los miotubos. N = 4 en cada grupo. Las barras de escala muestran 200 μm. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se realizó ANOVA unidireccional con un análisis post hoc para a – f. DEX, dexametasona. Vectores de adenovirus Ad-dnAMPK que contienen el gen de AMPKα2 dominante negativo, vectores de adenovirus Ad-β-gal que contienen el gen de β-galactosidasa.
La subunidad AMPKα tiene dos isoformas, α1 y α215. Para investigar las funciones específicas de isoformas de AMPKα en la regulación de la expresión de PGC1α y PGC1α4, se transfectaron miotubos C2C12 con ARNip dirigido a AMPKα1 o AMPKα2, o ARNip de control no relacionado. El tratamiento de miotubos C2C12 con ARNip dirigido a AMPKα1 y AMPKα2 redujo la expresión de AMPKα1 y AMPKα2 en un 76,1 ± 1,3 % y un 87,8 ± 1,0 % en comparación con el tratamiento de control con ARNip, respectivamente (Figura complementaria 9a). La eliminación de AMPKα1 no afectó los aumentos estimulados por mionectina en la expresión de PGC1α y PGC1α4 en miotubos C2C12 (Figura complementaria 9b). Es importante destacar que la ablación de AMPKα2 eliminó los aumentos estimulados por mionectina en la expresión de PGC1α y PGC1α4 en miotubos C2C12 (Figura complementaria 9c). Además, los miotubos C2C12 se transfectaron con ARNip dirigido a PGC1α o ARNip de control no relacionado. El tratamiento de miotubos C2C12 con ARNip dirigido a PGC1α redujo la expresión de PGC1α y PGC1α4 en un 75,5 ± 2,4% y un 75,8 ± 4,9% en comparación con el tratamiento de control con ARNip, respectivamente (Figura complementaria 10a). La eliminación de PGC1α canceló el aumento mediado por mionectina en el diámetro del miotubo en presencia de DEX (Fig. 5f). Además, la ablación de PGC1α revirtió el aumento estimulado por mionectina en la expresión de IGF1 en miotubos C2C12 en presencia de DEX (Figura complementaria 10b).
Para examinar si la sobreexpresión de PGC1α4 podría rescatar la reducción de los efectos antiatrofia de la mionectina inducida por la inactivación de AMPK, se transdujeron miotubos C2C12 con vectores adenovirales que expresaban PGC1α4 (Ad-PGC1α4) o Ad-βgal de control en presencia o ausencia de Ad-dnAMPK. El tratamiento de miotubos C2C12 con Ad-PGC1α4 aumentó los niveles de proteína de PGC1α4 (Figura complementaria 11a). El tratamiento con Ad-PGC1α4 revirtió los efectos supresores de la inactivación de AMPK sobre el aumento inducido por mionectina en el diámetro de los miotubos en presencia de DEX (Figura complementaria 11b). Estos datos indican que la mionectina podría proteger contra la atrofia de miotubos inducida por DEX a través de la vía dependiente de AMPKα2/PGC1α4.
Para evaluar el efecto terapéutico de la mionectina sobre la atrofia muscular, se administró de forma sostenible proteína mionectina recombinante al músculo gastrocnemio de ratones WT mediante el uso de hidrogel de gelatina inmediatamente después de la denervación quirúrgica. La administración de mionectina a ratones WT aumentó el peso del músculo gastrocnemio normalizado por el peso corporal después de la denervación a los niveles del músculo gastrocnemio no denervado (Fig. 6a). El tratamiento de ratones WT con mionectina no afectó el peso corporal después de la denervación en comparación con el tratamiento con vehículo (Figura complementaria 12a). Los pesos del músculo gastrocnemio denervado parecían ser mayores en ratones WT tratados con mionectina que en ratones WT tratados con vehículo, pero esto no fue estadísticamente significativo. No hubo diferencias significativas en el peso del músculo gastrocnemio no denervado entre los ratones WT tratados con vehículo y los ratones WT tratados con mionectina.
Se sometieron ratones a – c WT a la edad de 8 a 10 semanas a una operación de atrofia muscular inducida por denervación ciática. Se inyectó hidrogel de gelatina impregnado con mionectina recombinante (12 µg) o vehículo en la fascia del músculo gastrocnemio denervado justo antes de la denervación. Cinco días después de la denervación del nervio ciático, se utilizaron para el análisis los músculos gastrocnemios denervados y no denervados de ratones WT tratados con mionectina o con vehículo. a Relación peso del músculo gastrocnemio/peso corporal de ratones WT tratados con mionectina o vehículo. N = 5 en cada grupo. b Los paneles de la izquierda muestran imágenes representativas de fibras musculares transversales de ratones WT tratados con mionectina o vehículo. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos del área de sección transversal media (CSA) y la distribución de CSA del músculo gastrocnemio en ratones WT tratados con mionectina o vehículo. N = 5 en cada grupo. c Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de pAMPK, AMPK, PGC1α, PGC1α4 y tubulina. Los paneles de la derecha muestran análisis cuantitativos de las señales PGC1α, PGC1α4 y pAMPK normalizadas a la señal de tubulina. N = 5 en cada grupo. d, e Los ratones WT y DN-AMPK Tg de 8 a 10 semanas fueron sometidos a una operación de atrofia inducida por denervación ciática. Se inyectó hidrogel de gelatina impregnado con mionectina recombinante (12 µg) o vehículo en la fascia del músculo gastrocnemio denervado justo antes de la denervación. Cinco días después de la denervación del nervio ciático, se sacrificaron ratones WT y DN-AMPK Tg, y para el análisis se utilizaron músculos gastrocnemios denervados y no denervados. d Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de PGC1α, PGC1α4, IGF1 y tubulina. El panel derecho muestra análisis cuantitativos de las señales de PGC1α, PGC1α4 e IGF1 normalizadas a la señal de tubulina. N = 6 en cada grupo. e La proporción entre el músculo gastrocnemio y el peso corporal en ratones WT y DN-AMPK Tg tratados con mionectina o vehículo. N = 6 en cada grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM. Se realizaron la prueba t de Student no pareada de dos colas (c) y ANOVA unidireccional con un análisis post-hoc (a, b, d, e). Gastroc. músculo gastrocnemio, peso corporal BW, vehículo V, mionectina M, DN-AMPK Ratones transgénicos Tg que sobreexpresan la forma mutante negativa dominante de AMPK mediante un control del promotor de actina α-esquelética humana (HSA) específico del músculo esquelético.
En el análisis histológico, el tratamiento de ratones WT con mionectina aumentó significativamente la CSA media del músculo gastrocnemio desnervado (Fig. 6b). El tratamiento de ratones WT con mionectina aumentó la frecuencia de CSA más grande del músculo gastrocnemio desnervado. El tratamiento con mionectina no tuvo efectos sobre el peso del músculo gastrocnemio y el CSA del músculo en ratones WT no denervados. El tratamiento con mionectina aumentó significativamente el CSA medio de las fibras musculares tipo II en el músculo gastrocnemio en ratones WT denervados (Figuras complementarias 13a, b). El tratamiento con mionectina indujo una mayor distribución de tamaño de la fibra CSA tipo II del músculo gastrocnemio en ratones WT denervados (Figura complementaria 13b). Por el contrario, el tratamiento con mionectina no afectó la CSA media de las fibras musculares tipo I y su distribución en el músculo gastrocnemio en ratones WT denervados (Figuras complementarias 14a y 13b). El tratamiento con mionectina no tuvo efectos sobre las frecuencias de las fibras tipo I en el músculo gastrocnemio en ratones WT denervados (Figura complementaria 13c). Además, la administración de mionectina un día después de la denervación aumentó significativamente el peso del músculo gastrocnemio normalizado por el peso corporal en ratones WT (Figura 14 complementaria). Por lo tanto, estos datos indican que la suplementación con mionectina puede ser terapéuticamente eficaz para mejorar la atrofia muscular.
De acuerdo con los datos observados en los experimentos de pérdida de función, el tratamiento con mionectina aumentó los niveles de proteína de PGC1α y PGC1α4, y el nivel de fosforilación de AMPK en los músculos gastrocnemios después de la denervación (Fig. 6c). Para evaluar si AMPK está involucrado en los efectos beneficiosos de la mionectina sobre la atrofia muscular, se utilizaron ratones transgénicos que sobreexpresan la forma mutante negativa dominante de AMPK bajo el control del promotor de actina α-esquelética humana (HSA) específico del músculo esquelético (DN-AMPK Tg) para análisis. A diferencia de los ratones WT, los efectos estimulantes de la mionectina sobre los niveles de proteína de PGC1α, PGC1α4 e IGF1 en el músculo gastrocnemio después de la denervación no se observaron en ratones DN-AMPK Tg (Fig. 6d). De manera similar, la mionectina tuvo pocos efectos sobre el peso del músculo gastrocnemio por peso corporal después de la denervación en ratones DN-AMPK Tg (Fig. 6e). Además, se administró por vía intramuscular Ad-dnAMPK o Ad-β-gal al músculo gastrocnemio de ratones WT 3 días antes del tratamiento con mionectina. Aunque el tratamiento con mionectina aumentó el peso del músculo gastrocnemio por peso corporal de los ratones WT tratados con Ad-β-gal después de la denervación, no tuvo efectos sobre el peso del músculo gastrocnemio por peso corporal de los ratones WT tratados con Ad-dnAMPK después de la denervación (Figura complementaria 15). ). Estos resultados indican que el tratamiento con mionectina protege contra la atrofia muscular a través de la vía dependiente de AMPK/PGC1α.
Para evaluar el efecto de la mionectina sobre la sarcopenia asociada a la edad, se sometieron ratones 8 propensos a la senescencia acelerada del ratón (SAMP), que muestran un fenotipo de envejecimiento acelerado, a la administración intramuscular de Ad-mionectina o Ad-β-gal de control a la edad de 33 semanas. Los niveles de proteína mionectina en los tejidos del músculo gastrocnemio se redujeron significativamente en ratones SAMP8 en comparación con ratones SAMR1 de control a la edad de 37 semanas (Figura complementaria 16a). El tratamiento de ratones SAMP8 con Ad-mionectina aumentó los niveles de expresión de mionectina en el músculo gastrocnemio en un factor de 3,4 ± 0,5 en comparación con el tratamiento con Ad-β-gal (Figura complementaria 16b). 4 semanas después de la administración de Ad-β-gal o Ad-myonectina, los pesos del músculo gastrocnemio por peso corporal fueron significativamente mayores en ratones SAMP8 tratados con Ad-myonectina que en ratones SAMP8 tratados con Ad-β-gal (Fig. 7a). El peso corporal no difirió entre los ratones SAMP8 tratados con Ad-β-gal y los tratados con Ad-mionectina (Figura complementaria 12b). El peso del músculo gastrocnemio de los ratones SAMP8 tratados con Ad-mionectina parecía aumentar en comparación con el de los ratones SAMP8 tratados con Ad-β-gal, pero esto no fue estadísticamente significativo.
a – c Se inyectó por vía intramuscular Ad-mionectina (mionectina) o Ad-β-gal (control) en ratones SAMP8 a la edad de 33 semanas. 4 semanas después del tratamiento con mionectina o control, se sacrificaron ratones SAMP8 y se utilizaron los músculos gastrocnemios para el análisis. a Relación peso del músculo gastrocnemio/peso corporal de ratones SAMP8 tratados con mionectina o tratados con control. N = 5 en ratones SAMP8 antes del tratamiento. N = 7 en ratones SAMP8 después de mionectina o tratamiento de control. b Los paneles superiores izquierdos muestran imágenes representativas de fibras musculares de ratones SAMP8 antes del tratamiento o después del tratamiento con mionectina o control. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles inferiores muestran la cuantificación del área de sección transversal media (CSA) y la distribución de CSA de ratones SAMP8 antes del tratamiento o después del tratamiento con mionectina o control. N = 5 en cada grupo. c Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de PGC1α, PGC1α4 y tubulina en ratones SAMP8 antes del tratamiento o después del tratamiento con mionectina o control. Los gráficos de la derecha muestran análisis cuantitativos de las relaciones de señal de PGC1α/tubulina y PGC1α4/tubulina. N = 5 en cada grupo. d – f Se inyectó Ad-myonectina (mionectina) o Ad-β-gal (control) en los músculos gastrocnemios de ratones mdx a la edad de 4 semanas. 4 semanas después del tratamiento con mionectina o control, se sacrificaron los ratones mdx. d Relación peso del músculo gastrocnemio/peso corporal de ratones mdx tratados con mionectina o tratados con control. N = 5 en cada grupo. e Los paneles superiores muestran imágenes representativas de fibras musculares de ratones mdx tratados con mionectina o tratados con control. Las barras de escala muestran 100 μm. Los paneles inferiores muestran un análisis cuantitativo de la distribución media de CSA y CSA de ratones mdx tratados con mionectina o tratados con control. N = 5 en cada grupo. f Los paneles de la izquierda muestran análisis de transferencia Western representativos de PGC1α, PGC1α4 y tubulina. Los gráficos de la derecha muestran análisis cuantitativos de las relaciones de señal PGC1α/tubulina y PGC1α4/tubulina de ratones mdx tratados con mionectina o tratados con control. N = 5 en cada grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM. ANOVA unidireccional con análisis post hoc para a – c. Prueba t de Student de dos colas no pareada para d – f. Gastroc. músculo gastrocnemio, peso corporal BW, senescencia acelerada de ratón propenso 8 SAMP8, vectores adenovirales Ad-β-gal que contienen el gen de la β-galactosidasa, vectores de adenovirus Ad-mionectina que contienen el gen de la mionectina.
El análisis histológico también mostró que el tratamiento con Ad-mionectina aumentó la CSA media del músculo gastrocnemio en ratones SAMP8 en comparación con el tratamiento con Ad-β-gal (Fig. 7b). El tratamiento con ad-mionectina también mejoró los niveles de proteína de PGC1α y PGC1α4 en el músculo gastrocnemio en ratones SAMP8 (Fig. 7c).
Finalmente, evaluamos el efecto de la mionectina sobre la atrofia muscular en ratones mdx, que es un modelo genético de distrofia muscular. Los niveles de proteína mionectina en el músculo gastrocnemio se redujeron significativamente en ratones mdx en comparación con los ratones WT de control a la edad de 8 semanas (Figura complementaria 17a). Se sometieron ratones Mdx de 4 semanas de edad a una administración intramuscular de Ad-β-gal o Ad-mionectina. El tratamiento de ratones mdx con Ad-myonectina aumentó los niveles de expresión de mionectina en el músculo gastrocnemio en un factor de 3,7 ± 0,4 en comparación con el tratamiento con Ad-β-gal (Figura complementaria 17b). 4 semanas después de la administración de Ad-β-gal o Ad-myonectina, el peso del músculo gastrocnemio por peso corporal fue significativamente mayor en los ratones mdx tratados con Ad-myonectina que en los ratones mdx tratados con Ad-β-gal (Fig. 7d). El peso corporal no difirió entre los ratones mdx tratados con Ad-β-gal y los tratados con Ad-mionectina (Figura complementaria 12c). El peso del músculo gastrocnemio tendió a ser mayor en ratones mdx tratados con Ad-mionectina que en ratones mdx tratados con Ad-β-gal, pero esto no fue estadísticamente significativo.
El análisis histológico demostró que el tratamiento con Ad-mionectina aumentó la CSA del músculo gastrocnemio en ratones mdx en comparación con el tratamiento con Ad-β-gal (Fig. 7E). Los niveles de proteína de PGC1α y PGC1α4 en el músculo gastrocnemio de ratones mdx también aumentaron con el tratamiento con Ad-mionectina (Fig. 7f). Además, el tratamiento de ratones mdx con tratamiento con Ad-mionectina condujo a una mayor expresión de la cadena pesada de miosina embrionaria (Myh3) y a la frecuencia de células con núcleos centrales positivos en los tejidos del músculo gastrocnemio, lo que indica la promoción de la regeneración del músculo esquelético (Figura complementaria 17c). , d). En conjunto, estos hallazgos indicaron que el tratamiento con mionectina podría ser eficaz para mejorar varios tipos de atrofia muscular, incluida la sarcopenia asociada a la edad y la distrofia muscular genética.
En el presente estudio, proporcionamos evidencia de que la mionectina funciona como un modulador de la masa y función del músculo esquelético. Los ratones de edad avanzada mostraron una marcada reducción de la expresión de mionectina en el músculo esquelético. La deficiencia de mionectina provocó una atrofia exacerbada del músculo esquelético, en particular de la fibra muscular tipo II, en ratones de edad avanzada, que fue acompañada por una reducción de la fuerza muscular y la capacidad de ejercicio. La deficiencia de mionectina también resultó en una atrofia del músculo esquelético agravada en modelos de atrofia muscular inducida por denervación ciática o inducida por DEX. Por el contrario, la administración de mionectina un día o inmediatamente después de la denervación mejoró la atrofia muscular en ratones. Los experimentos in vitro también demostraron que la mionectina revertía la atrofia de miofibras inducida por DEX. Además, la administración intramuscular de mionectina mejoró la progresión espontánea de la atrofia muscular en modelos de ratón SAMP8 de envejecimiento acelerado o modelos de distrofia muscular en ratón mdx. Por lo tanto, múltiples líneas de evidencia indican que la mionectina puede actuar como un factor protector contra la disfunción del músculo esquelético, lo que sugiere que la mionectina puede representar un objetivo terapéutico para la atrofia muscular.
La disfunción mitocondrial ha estado implicada en trastornos del músculo esquelético como la sarcopenia16. El entrenamiento físico promueve la función mitocondrial del músculo esquelético y beneficia la prevención o el tratamiento de diversas afecciones crónicas, incluidas la disfunción metabólica y la sarcopenia17. PGC1α es un corregulador transcripcional inducido por el entrenamiento físico y controla el metabolismo energético mitocondrial18,19. Los ratones transgénicos PGC1α exhiben biogénesis mitocondrial activada en el músculo esquelético y una mayor resistencia a la fatiga20. La deficiencia de PGC1α conduce a anomalías exacerbadas de la estructura y función mitocondrial y a una disminución del rendimiento en el ejercicio21,22. Nuestros hallazgos demostraron que la deficiencia de mionectina contribuye a la reducción de la vía dependiente de PGC1α y a la exacerbación de la disfunción mitocondrial y la atrofia de miofibras en el músculo esquelético denervado en ratones. La deficiencia de mionectina también participa en la mejora de la atrofia del músculo esquelético y la reducción de la fuerza muscular y la capacidad de ejercicio en ratones de edad avanzada. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la mionectina protege contra la disfunción muscular, al menos en parte, mediante la modulación de la función mitocondrial dependiente de PGC1α.
La PGC1α en el músculo esquelético se activa mediante AMPK, AMP cíclico (AMPc)/proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB) y vías de quinasa dependiente de calmodulina después del entrenamiento físico23,24,25. El tratamiento de ratones con AICAR, que es un activador de AMPK, conduce a una mayor resistencia al correr, que se acompaña de mayores niveles de expresión de PGC1α en el músculo esquelético26. De acuerdo con estos hallazgos, nuestros hallazgos actuales indican que AMPK funciona como un precursor de PGC1α en el músculo esquelético después del tratamiento con mionectina. Por lo tanto, es posible que la mionectina pueda mejorar la disfunción del músculo esquelético a través del mecanismo dependiente de AMPK/PGC1α. En este momento no se sabe nada sobre el mecanismo por el cual la mionectina activa la vía de señalización de AMPK, y esto necesita más investigación.
Se informa que PGC1α4 induce hipertrofia del músculo esquelético en parte mediante la regulación de la expresión de IGF114. Nuestros datos actuales documentan que la mionectina regula positivamente la expresión de proteínas de PGC1α4 e IGF1 en el músculo esquelético y los miotubos C2C12. Se ha demostrado que AMPKα2 regula la expresión de PGC1α4 en células C2C1215. Consistentemente, nuestros experimentos de eliminación de genes mostraron que la mionectina aumenta la expresión de PGC1α4 en miotubos C2C12 a través de la vía dependiente de AMPKα2. Además, la mionectina mejora la expresión de PGC1α4 e IGF1 en el músculo esquelético in vivo a través de la vía dependiente de AMPK. Por lo tanto, es probable que la mionectina aumente la expresión de la proteína PGC1α4 en el músculo esquelético mediante la activación de AMPKα2. Además, la eliminación de PGC1α mediada por ARNip, que también reduce la expresión de PGC1α4, bloquea el efecto antiatrofia de la mionectina en los miotubos C2C12. Además, la sobreexpresión de PGC1α4 rescata la reducción de la acción antiatrofia de los miotubos de la mionectina inducida por la inactivación de AMPK. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la mionectina podría prevenir la atrofia muscular, al menos en parte, a través de mecanismos dependientes de AMPKα2/PGC1α4/IGF-1.
El entrenamiento con ejercicios de resistencia es eficaz para reducir el riesgo de enfermedades cardiometabólicas27,28. Se ha informado que la mionectina regula negativamente la adipogénesis y la acumulación de tejido adiposo6,8. Recientemente hemos demostrado que la mionectina mejora la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones9. Es de destacar que también hemos demostrado que el ejercicio de resistencia aumenta el músculo esquelético y los niveles circulantes de mionectina, y que la mionectina media los efectos beneficiosos del ejercicio de resistencia en los corazones isquémicos. Nuestros datos actuales indican que la mionectina regula positivamente las señales de AMPK/PGC1α en el músculo esquelético, que pueden activarse mediante entrenamiento de resistencia. En conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento con mionectina podría imitar las acciones saludables del entrenamiento con ejercicios de resistencia en una serie de condiciones patológicas.
La atrofia muscular inducida por el desuso puede ocurrir a lo largo de la vida humana y disminuir la calidad de vida29. Los niveles de expresión de PGC1α disminuyen notablemente en respuesta a la denervación o el desuso del músculo esquelético, y el mantenimiento de los niveles de PGC1α conduce a la protección contra la atrofia muscular. Nuestros hallazgos in vivo indican que la mionectina puede mejorar la atrofia muscular inducida por la denervación a través de su capacidad para aumentar la expresión de PGC1α. La atrofia muscular inducida por glucocorticoides también está implicada en la mala calidad de vida y es uno de los problemas sociales graves. Los esteroides, incluido el DEX, inducen atrofia del músculo esquelético mediante la activación de FoxO, atrogina-1 y MuRF-130,31 mediada por receptores de glucocorticoides. Además, DEX atenúa la expresión de PGC1α en los miotubos L6 al reducir el coactivador 2 de la transcripción regulado por CREB, que es un regulador positivo de PGC1α32. Nuestros experimentos de eliminación de genes demostraron que los efectos supresores de la mionectina sobre la atrofia de las miofibras dependen en parte de su capacidad para inducir la expresión de PGC1α. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la mionectina podría mejorar la atrofia muscular inducida por el desuso y el uso de esteroides mediante la regulación positiva de la expresión de PGC1α.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad progresiva temprana y potencialmente mortal. En la primera infancia, los pacientes con DMD sufren síntomas de debilitamiento muscular, lo que finalmente conduce a la pérdida de la deambulación entre los 8 y los 12 años. Recientemente, se han desarrollado terapias de omisión de exones que son efectivas para mitigar los síntomas de los pacientes con DMD. mutación de distrofina aplicable a métodos de omisión de exón33. Por otro lado, a la mayoría de los pacientes con DMD con la mutación de la distrofina no se les pueden aplicar métodos de omisión de exón34. En el presente estudio, encontramos que el tratamiento con mionectina atenúa la progresión de la distrofia muscular de ratones mdx, que es un modelo murino de DMD. Se ha informado que los ratones transgénicos PGC1α específicos del músculo esquelético cruzados con ratones mdx exhiben una mejor atrofia muscular, rendimiento en carrera y niveles plasmáticos de creatina quinasa en comparación con los ratones mdx35. Además, la sobreexpresión transitoria de PGC1α en el músculo esquelético mediante transfección de plásmidos ejerce acciones saludables sobre la función mitocondrial en ratones mdx36. Por lo tanto, estos hallazgos indicaron que la mionectina podría prevenir la distrofia muscular de ratones mdx a través de la biogénesis mitocondrial estimulada por PGC1α, lo que sugiere que la mionectina puede representar un objetivo terapéutico potencial para la DMD.
En conclusión, nuestro presente estudio es el informe de que la mionectina sirve como un factor protector para la disfunción del músculo esquelético causada por diversas condiciones fisiopatológicas, como la atrofia muscular asociada a la edad, inducida por desuso o inducida por esteroides. Debido a que la expresión de mionectina en el músculo esquelético se redujo notablemente en asociación con diversas condiciones de atrofia muscular, los enfoques para aumentar la producción de mionectina en el músculo disfuncional podrían ser potencialmente valiosos para la prevención o el tratamiento de la atrofia del músculo esquelético relacionada con la edad.
Anticuerpos contra AMPK fosforilada (Thr172)(Cat. 2531 S)(diluida a 1:1000), AMPK (Cat. 2532 S)(diluida a 1:1000), ACC fosforilada (Ser79)(Cat. 3661)(diluida a 1 :1000), ACC (Cat. 3662)(diluido a 1:1000), COX4 (Cat. 4844)(diluido a 1:1000) y α-tubulina (Cat. 2144 S)(diluido a 1:1000) de Tecnología de Señalización Celular. Los anticuerpos contra AMPKα1 (Cat. ab3759) (diluido a 1:1000), AMPKα2 (Cat. ab3760) (diluido a 1:1000) y OXPHOS total (Cat. ab110413) (diluido a 1:500) se adquirieron de Abcam. El anticuerpo contra mionectina se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Cat. sc-246565) (diluido a 1:2500). El anticuerpo contra IGF1 (Cat. AF-791) se adquirió de R&D Systems, Inc. (diluido a 1:500). El anticuerpo contra PGC1α (PGC1α y PGC1α4) se adquirió de Calbiochem (Cat.ST1202-1SETCN). Miosina anti-lenta monoclonal de ratón (Clon NOQ7.5.4D) (Cat. SAB4200670) (diluida a 1:10000) y miosina anti-lenta monoclonal de ratón (Clon MY-32) (Cat. M4276) (diluida a 1:800) fueron adquiridos de Sigma. El anticuerpo IgG anti-conejo unido a HRP de cabra (Cat. 7074) y el anticuerpo IgG anti-ratón unido a HRP de caballo (Cat. 7076) se adquirieron de Cell Signaling Technology (diluido a 1:5000). El anticuerpo bovino anti-IgG de cabra unido a HRP (Cat. sc-2384) se adquirió de Santa Cruz (diluido a 1:2000). El hidrogel de gelatina biodegradable se adquirió de Nitta Gelatin Inc.. La dexametasona (DEX) se adquirió de Cayman Chemical Co.. La proteína de mionectina de ratón recombinante se preparó mediante el uso de un vector de expresión de mamífero que codifica el ADNc9 de mionectina de ratón de longitud completa (Fam132b).
Se construyeron vectores adenovirales que expresan mionectina de ratón de longitud completa (Ad-myonectin), PGC1α4 de ratón (Ad-PGC1α4) o β-galactosidasa (Ad-β-gal) bajo el control del promotor CMV. Se prepararon vectores adenovirales que expresan la forma mutante negativa dominante de AMPKα2 (Ad-dnAMPK) mediante el uso del ADNc de AMPKα2 de rata, cuyo residuo de lisina 45 se cambió a arginina, con la etiqueta del epítopo c-Myc37.
Se adquirieron ratones macho C57BL/6 J de tipo salvaje (WT) de SLC Co Ltd.. Los ratones knockout para Myonectin (Fam132b) (myonectin-KO) fueron generados originalmente por Lexicon Pharmaceuticals, Inc. (Woodlands, TX) y se obtuvieron de Taconic Biosciences, Inc (Nueva York, EE. UU.) 9. Se generaron ratones mionectina-KO en un entorno de C57BL/6 y en este estudio se utilizaron mionectina-KO macho homocigotos. La forma mutante negativa dominante impulsada por el promotor del promotor de actina a esquelética humana (HSA) de ratones macho transgénicos AMPK (DN-AMPK Tg) en un fondo de C57BL/6 se adquirió de JCRB (Colección Japonesa de Bancos de células de recursos biológicos de investigación) Laboratory Animal Resource Banco en NIBIOHN (Instituto Nacional de Innovación Biomédica, Salud y Nutrición. Osaka, Japón)38. Se adquirieron ratones mdx macho con un fondo de C57BL/6 de Chubu Kagaku Shizai Co., Ltd. (Nagoya, Japón). Se adquirieron ratones macho SAMP8 (SAMP8/TaSlc) y ratones macho SAMR1/TaSlc de control en un fondo de AKR/J de Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japón). Los ratones se alojaron a 20-22 °C y 50% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones tuvieron libre acceso al agua y a la comida estándar (CE-2, CLEA Japan Inc.). Los ratones se sacrificaron en los momentos indicados después de la anestesia con medetomidina, midazolam y butorfanol en dosis de 0,15, 2,0 y 2,5 mg/kg, respectivamente. Se recolectaron músculos para análisis histológico y molecular. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya. Los ratones fueron observados de cerca y sacrificados rápidamente, en un punto final humano (sin locomoción o pérdida de peso corporal superior al 20% del peso corporal inicial).
Para el análisis se utilizaron ratones macho WT y mionectina-KO a la edad de 80 semanas. La fuerza de agarre se midió para evaluar la calidad del músculo utilizando un medidor de fuerza de agarre para animales pequeños (Columbus Co., Largo, FL). La actividad voluntaria de los ratones se midió mediante un sistema de ruedas (Melquest Ltd., Toyama).
Se trataron continuamente ratones macho WT y mionectina-KO de 8 a 10 semanas de edad con dexametasona (DEX) configurando minibombas osmóticas Alzet (Modelo 2002, Durect Corp.) a una dosis de 23 µg/día durante 14 días.
La denervación se realizó mediante extirpación quirúrgica del nervio ciático de la extremidad trasera derecha de ratones macho WT, mionectina-KO y DN-AMPK Tg a la edad de 8 a 10 semanas39. En algunos experimentos, se inyectó hidrogel de gelatina impregnado con mionectina recombinante (12 µg) en la fascia del músculo gastrocnemio justo antes o un día después de la denervación. En algunos experimentos, se inyectó Ad-dnAMPK o Ad-β-gal (3 × 108 unidades formadoras de placa/ratón) en gastrocnemios de ratones WT 3 días antes de la denervación. Cinco días después de la extirpación del nervio ciático, los ratones se sacrificaron para su análisis.
Se inyectaron vectores adenovirales que expresan mionectina (Ad-myonectin) o β-galactosidasa (Ad-β-gal) (1 × 108 unidades formadoras de placas/ratón) en músculos gastrocnemios de ratones macho C57BL/10-mdx a la edad de 4 semanas. . 4 semanas después del tratamiento con Ad-mionectina o Ad-β-gal, se sacrificaron ratones mdx para su análisis.
Se inyectó Ad-mionectina o Ad-β-gal (1 × 108 unidades formadoras de placa/ratón) en los músculos gastrocnemios de ratones macho SAMP8 y control SAMR1 a la edad de 33 semanas. 4 semanas después del tratamiento con Ad-mionectina o Ad-β-gal, se sacrificaron ratones SAMP8 para su análisis.
A los ratones se les permitió agarrar una rejilla horizontal conectada a un medidor de fuerza de agarre para animales pequeños (Columbus Co., Largo, FL) con las extremidades anteriores o con las cuatro extremidades40. La fuerza aplicada a la rejilla cada vez antes de que el animal perdiera su agarre se registró en Newton. El promedio de las cinco mediciones se normalizó al peso corporal total.
Los ratones se alojaron individualmente en una jaula con una rueda para correr (Melquest Ltd., Toyama, Japón). Cada rueda tenía un indicador magnético y un sensor de efecto Hall que se conectaba a una interfaz de computadora y registraba las revoluciones de la rueda. Diariamente se recopilaron datos voluntarios de funcionamiento de la rueda (número de rotaciones) y se revisó a los ratones para garantizar que la rueda todavía funcionaba correctamente. Se proporcionó un período introductorio de cinco días antes de las mediciones de datos.
Los tejidos extirpados de gastrocnemio y sóleo se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Se cortaron muestras de tejido con un espesor de 6 µm y las secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). El CSA medio de las fibras se determinó utilizando el software Image J (Instituto Nacional de Salud). La tinción inmunohistoquímica se realizó con un anticuerpo monoclonal contra la miosina esquelética lenta (NOQ7.5.4D, Sigma) y rápida (MY-32, Sigma).
Se utilizó el kit RNeasy Mini (Qiagen) para extraer el ARNm total del músculo y las células del gastrocnemio. El ADNc se sintetizó utilizando un kit ReverTra Ace (TOYOBO). El análisis cuantitativo de PCR se realizó con un sistema de detección de PCR en tiempo real BioRad (TOYOBO). Los cebadores de qPCR se enumeran en la tabla complementaria. Los niveles de expresión de los genes examinados se dividieron por el nivel correspondiente de 36B4 y se presentaron en relación con el control.
Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ARN para cada muestra con 1 μg de ARN total utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARNm trenzado Illumina TruSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se completó la secuenciación de extremos emparejados de 150 pb en Illumina NovaSeq 6000. El análisis de datos de RNA-seq se realizó realizado con algunas modificaciones41. Brevemente, la calidad de los datos de secuencia sin procesar se evaluó utilizando FastQC (Versión: FastQC 0.10.0). ¡Los archivos FASTQ se recortaron para adaptadores y puntuación Phred (>20) usando TrimGalore! (0.6.4). Las lecturas secuenciadas recortadas se alinearon con el conjunto del genoma del ratón (GRCm39 GENCODE vM30) usando STAR (2.7.3a)42. Se utilizaron lecturas alineadas para cuantificar el ARNm con el recuento HTSeq (versión 0.11.2)43. El análisis de expresión génica diferencial entre muestras se realizó utilizando el paquete DESeq2 (1.32.0) en genes codificadores de proteínas44. Los genes se seleccionaron como expresados diferencialmente cuando el valor de p ajustado por FDR estaba por debajo de 0,05 y un cambio absoluto de log2 estaba por encima de 0,5. Los análisis se realizaron utilizando R (4.1.0). El análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) se realizó utilizando la herramienta bioinformática en línea Base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID, v6.8) para genes expresados diferencialmente en un FPKM (Fragmentos por kilobase de kilobase de exón). por millón de fragmentos mapeados) valor de ≥1 en al menos tres de las muestras.
Las muestras de músculo esquelético y células C2C12 se solubilizaron con tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Cat 9803 S) y cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Cat 11697498001). La concentración de proteína se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific). Se separaron cantidades iguales de proteínas mediante SDS-PAGE desnaturalizante, seguido de transferencia a una membrana de PVDF (GE Healthcare). Las membranas se expusieron al anticuerpo primario seguido de la incubación con el anticuerpo secundario conjugado con HRP. La señal de la proteína fue detectada por el sistema ECL Prime (GE Healthcare). Los niveles de expresión se determinaron midiendo las intensidades de las bandas correspondientes utilizando el software Image J (Instituto Nacional de Salud)45. Los valores relativos de la banda correspondiente se evaluaron mediante intensidades relativas a la señal de α-tubulina.
Los músculos gastrocnemios se recortaron en tiras de aproximadamente 1,0 mm3 y se fijaron en una mezcla de glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 2% durante 18 a 20 h, seguido de tetróxido de osmio al 2% durante 2 h. Luego, los tejidos se deshidrataron y se embebieron en epoxi. Se trataron secciones ultrafinas (80 nm de espesor) con citrato de plomo y se observaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (Hitachi, Japón). De cada muestra se tomaron al azar un mínimo de 10 microfotografías. El número de mitocondrias se contó en micrografías de forma ciega46.
Las mitocondrias se definieron como alteradas según criterios validados por estudios morfológicos previos47 de la siguiente manera: (1) disminución significativa de la densidad electrónica de la matriz (dilución, vacuolización, cavitación); (2) crestas fragmentadas y abombadas (hinchazón intracristalina); (3) separación parcial o completa de las membranas exterior e interior; (4) inflamación mitocondrial. En consecuencia, se calcularon los siguientes datos: (1) densidad de mitocondrias, (2) porcentaje de mitocondrias alteradas, (3) hinchazón mitocondrial, evaluados midiendo el diámetro mitocondrial máximo y mínimo.
La actividad de la citrato sintasa se determinó con el kit de ensayo de actividad de citrato sintasa MitoCheck (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad de la citrato sintasa se normalizó aún más con respecto al contenido de proteínas.
Las células C2C12 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (CRL-1772). Los mioblastos se cultivaron en DMEM con bajo contenido de glucosa (Sigma-Aldrich Co. EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina-estreptomicina al 1 % (pen/strep). Los mioblastos se diferenciaron en miotubos cambiando a medio de diferenciación (DMEM, 2 % de suero de caballo, 1 % de pluma/estreptococo) durante 5 días. Los miotubos C2C12 se trataron previamente con proteína mionectina (5 µg/ml) o vehículo durante 1 hora, seguido de estimulación con DEX (100 µM) o vehículo durante 24 horas. Para los experimentos de ablación de genes, estas células se transfectaron con pequeños ARN de interferencia (ARNip) dirigidos a PGC1α (L040773-01-0005), AMPKα1 (L-041035-00-0005), AMPKα2 (L-040809-00-0005) y no relacionados ( D-001810-10-05) ARNip (Dharmacon Inc., Lafayette, CO) mediante el regente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) según el protocolo del fabricante. 24 horas después de la transfección, las células se sometieron al experimento de atrofia inducida por DEX. El diámetro del miotubo se determinó a partir del diámetro promedio del miotubo al menos en diez campos de alta potencia por pocillo utilizando el software Image J (Instituto Nacional de Salud)45.
Los datos se muestran como media ± SEM. Las diferencias entre dos grupos para variables con distribuciones normales se evaluaron mediante la prueba t de Student no apareada. Las diferencias entre tres o más grupos se evaluaron mediante análisis de varianza unidireccional, con una prueba de Tukey post-hoc o una prueba de Games-Howell, considerada apropiada en presencia de heterogeneidad de varianza. Un valor de AP < 0,05 denota la presencia de una diferencia estadísticamente significativa. Todos los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software IBM SPSS Statistics 28 (SPSS Inc).
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.
Cualquier información adicional sobre los datos puede estar disponible a través de los autores correspondientes previa solicitud. Los datos de secuenciación de ARN generados en este estudio se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus GEO con el código de acceso GSE233328. Los datos originales se proporcionan con este documento.
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Agradecemos la asistencia técnica de Yoko Inoue. Este trabajo fue apoyado por la Subvención para Investigación Científica A (2620H005710), la Subvención para Investigación Exploratoria Desafiante (2620K21753) y subvenciones de la Takeda Science Foundation (2600007594 y 2600007051) para N Ouchi (NO). KO recibió el apoyo de una subvención para la investigación científica C (2621K08101). Este trabajo fue apoyado, en parte, por JST CREST (número de subvención JPMJCR19H4)(TM).
Departamento de Cardiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón
Yuta Ozaki, Naoya Otaka, Hiroshi Kawanishi, Tomonobu Takikawa, Lixin Fang, Kunihiko Takahara, Sohta Ishihama, Mikito Takefuji, Katsuhiro Kato, Yuuki Shimizu, Yasuko K. Bando y Toyoaki Murohara
Departamento de Medicina Molecular y Cardiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón
Koji Ohashi, Minako Tatsumi y Noriyuki Ouchi
Instituto de Innovación para la Sociedad del Futuro, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón
Aiko Inoue y Masafumi Kuzuya
Departamento de Atención Médica Comunitaria y Geriatría, Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón
Masafumi Kuzuya
Laboratorio de Bioquímica Nutricional, Escuela de Graduados en Ciencias Ambientales y Nutricionales, Universidad de Shizuoka, Shizuoka, Japón
Shinji Miura
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YO diseñó el estudio de investigación, realizó los experimentos, adquirió los datos, los analizó y escribió el manuscrito. KO diseñó el estudio de investigación, realizó los experimentos, adquirió los datos, los analizó, proporcionó experiencia relacionada con los experimentos y escribió el manuscrito. NO (N. Otaka), HK, TT, LF, KT, MT (M. Tatsumi), SI realizaron los experimentos, adquirieron los datos y analizaron los datos. KK analizó los datos de RNA-seq. MT (M. Takefuji), YS, YKB, AI, MK y TM diseñaron el estudio de investigación y proporcionaron experiencia relacionada con los experimentos. SM proporcionó ratones DN-AMPK Tg y brindó experiencia relacionada con los experimentos. NO (N. Ouchi) diseñó el estudio de investigación, analizó los datos, brindó experiencia relacionada con los experimentos y escribió el manuscrito. Todos los autores participaron en la interpretación de los resultados y la revisión del manuscrito.
Correspondencia a Koji Ohashi o Noriyuki Ouchi.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.
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Ozaki, Y., Ohashi, K., Otaka, N. et al. La mionectina protege contra la disfunción del músculo esquelético en ratones macho mediante la activación de la vía AMPK/PGC1α. Nat Comuna 14, 4675 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40435-2
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Recibido: 01 de agosto de 2022
Aceptado: 28 de julio de 2023
Publicado: 04 de agosto de 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40435-2
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