Evaluación comparativa de campos de fuerza para caracterizar el R2 intrínsecamente desordenado

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14226 (2023) Citar este artículo

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Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) desempeñan un papel crucial en numerosas enfermedades como el Alzheimer y la ELA al formar fibrillas de amiloide irreversibles. La eficacia de los campos de fuerza (FF) desarrollados para proteínas globulares y sus versiones modificadas para los desplazados internos varía según la proteína específica. Este estudio evalúa 13 FF, incluidos AMBER y CHARMM, mediante la simulación de la región R2 del dominio FUS-LC (región R2-FUS-LC), un IDP implicado en la ELA. Debido a la flexibilidad de la región, demostramos que utilizar múltiples medidas, que evalúan las conformaciones locales y globales, y combinarlas en una puntuación final es importante para una evaluación integral de los campos de fuerza. Los resultados sugieren que c36m2021s3p con el modelo de agua mTIP3p es el FF más equilibrado, capaz de generar varias conformaciones compatibles con las conocidas. Además, el modelo de agua mTIP3P es computacionalmente más eficiente que los de los AMBER FF mejor clasificados con modelos de agua de cuatro sitios. La evaluación también revela que los AMBER FF tienden a generar conformaciones más compactas en comparación con los CHARMM FF, pero también más contactos no nativos. Los FF AMBER y CHARMM de alto rango pueden reproducir contactos intrapéptidos, pero tienen un rendimiento inferior para los contactos interpéptidos, lo que indica que hay margen de mejora.

Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) son proteínas que pueden formar diferentes conformaciones según el entorno y sus socios de unión1. Algunos desplazados internos pueden autoagregarse para formar fibrillas de amiloide que adoptan la estructura β cruzada2. La estructura β cruzada consta de proteínas/péptidos de cadena beta que se apilan a lo largo de la fibra formando largas láminas beta llamadas protofibrillas. Finalmente, los complejos de protofibrillas forman fibrillas de amiloide3.

Las fibrillas de amiloide están asociadas con enfermedades4,5 como Alzheimer, Parkinson, diabetes tipo II, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA)4,6,7 y otras. La ELA es una enfermedad neurodegenerativa poco común8,9 donde en el 50% de los casos la muerte ocurre dentro de los tres años posteriores a la primera manifestación clínica10. En pacientes con ELA, se han encontrado mutaciones de aminoácidos en la región de baja complejidad (LC) de la proteína fusionada en el sarcoma (FUS)11,12,13,14,15,16. Se ha observado agregación irreversible de fibrillas de amiloide en la región FUS-LC mutada, mientras que se observan fibrillas reversibles en el tipo salvaje11,16,17.

La proteína FUS humana (526 residuos) participa en el empalme y la transcripción del ARNm. El núcleo FUS-LC33–96 participa en la formación de fibrillas de amiloide11,17,18,19,20,21 y contiene cuatro motivos repetidos (R1-R2-R3-R4)17 (Fig. S1, recuadros violetas). Dentro de R1/R2, los motivos en tándem [S/G]Y[S/G] se han implicado en la formación de núcleos de fibrillas de amiloide reversibles (RAC)17 (Fig. 1 y Fig. S1). Se sabe que la región R2 es más importante para la formación de fibrillas que la R122,23. Las estructuras del núcleo FUS-LC33–9616,24 (Fig. 1) muestran que la región R2 tiene pocos contactos a larga distancia con el resto del dominio del núcleo LC (Fig. S2). Por tanto, la región R2-FUS-LC50-65 es una buena candidata para estudiar la fibrilación amiloide.

Organización del dominio de la proteína fusionada en sarcoma (FUS) de longitud completa. El dominio FUS N-terminal de baja complejidad (LC) (residuos 1 a 214) contiene un dominio similar a prión rico en QGSY (1 a 165, cuadro violeta) y una región rica en Gly (166 a 214, cuadro rosa). Dentro del dominio rico en QGSY, hay cuatro motivos repetidos (R1 – R2 – R3 – R4). Dentro de R2 (región R2-FUS-LC) hay un núcleo de fibrillas de amiloide reversible (RAC 2) que participa en la formación de fibrillas. Tomamos sólo la región R2-FUS-LC para estudiar la fibrilación FUS. En el interior del cuadrado rojo superior hay dos conformaciones diferentes resueltas experimentalmente de la región R2-FUS-LC. A la izquierda, seis representantes de la región R2-FUS-LC seleccionados entre los 20 modelos de la estructura de RMN (PDB ID: 5W3N16, “en forma de U”). A la derecha, el modelo crio-EM de PDB ID: 7VQQ24, “en forma de L”. La figura se preparó con Microsoft PowerPoint y VMD v1.9.325 (https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/).

Nuestro conocimiento actual del mecanismo de agregación de fibrillas de amiloide es deficiente. Además, se ha informado que algunas de las estructuras intermedias transitorias de los desplazados internos son tóxicas26. Un método para estudiar la formación de fibrillas y sus intermediarios es realizar simulaciones de dinámica molecular (MD) de todos los átomos. Los péptidos β amiloides que forman las fibrillas de amiloide en la enfermedad de Alzheimer se estudian habitualmente mediante simulaciones de DM27,28,29.

Sin embargo, los datos experimentales y los resultados de las simulaciones suelen mostrar discrepancias27,30. Una de las principales razones de esto es que los campos de fuerza de todos los átomos (FF) como AMBER, CHARMM31,32, OPLS-AA33,34 y GROMOS35,36 se desarrollaron para reproducir las propiedades de proteínas globulares estables. Por el contrario, los IDP adoptan múltiples conformaciones inestables donde los residuos no polares a menudo quedan expuestos al disolvente. Múltiples grupos de investigación han ajustado los FF para reproducir mejor los datos experimentales27,37,38,39,40,41,42 [Tabla S1 y Sup. Información. Sección Benchmark de Campos de Fuerza (FF) y Modelos de Agua (WM)]. No está claro si estos FF modificados son generalizables a todos los desplazados internos. Tenga en cuenta que a lo largo del texto, cuando nos referimos a los FF, nos referimos al resultado o propiedades observadas al realizar simulaciones con los respectivos FF.

En este trabajo, aplicamos campos de fuerza MD ampliamente utilizados para estudiar los desplazados internos al R2-FUS-LC (Fig. 1 y Fig. S1) para evaluar si pueden muestrear conjuntos conformacionales de fibrillas que sean consistentes con los datos experimentales. Seleccionamos diez FF y modelos de agua (WM) desarrollados recientemente para los desplazados internos. A modo de comparación, incluimos los FF c27s3p, a99sb4pew y a14sb3p que se utilizaron para desarrollar algunos de los FF para desplazados internos. Calificamos estos trece FF en función de tres criterios: la compacidad de las fibrillas, los contactos intrapéptidos en el estado cruzado-β y la propensión a la estructura secundaria. Sorprendentemente, la mayoría de los FF no logran reproducir los datos experimentales. Nuestro método de puntuación sugiere que CHARMM36m2021 FF con el modelo de agua mTIP3P es el mejor para estudiar la fibrilación R2-FUS-LC.

Realizamos seis simulaciones de MD, cada una con una duración de 500 ns, con un total de 3 μs, con cada uno de los trece FF (Tabla S1). Para evaluar los FF contra la región reversible de fibrillas de amiloide R2-FUS-LC (trímero de péptidos de 16 residuos), empleamos tres medidas: radio de giro (Rg), propensión a la estructura secundaria (SSP) y mapa de contacto intrapéptido. Rg mide la compacidad/extensión global del trímero y los péptidos individuales (Fig. S3). Tanto el SSP como el mapa de contacto intrapéptido se refieren a los detalles de contacto local de la región R2-FUS-LC. Clasificamos los trece FF en función de una puntuación combinada derivada de estas tres medidas (Tabla 1, Puntuación final).

Según la puntuación final (Tabla 1), los trece FF se pueden separar en tres grupos distintos: grupos de clasificación superior (“*”), medio (“•”) e inferior (“#”) según el orden de las puntuaciones.

Los FF del grupo “superior” tienen puntuaciones medias (0,3–0,7) a altas (> 0,7) en todas las medidas. Los FF en el grupo "inferior", como c27s3p y a03ws, tienen puntuaciones bajas (<0,3) en las tres medidas. Sin embargo, a14sb3p se destaca con puntuaciones relativamente buenas para SSP y mapa de contactos, pero una puntuación Rg baja. Por otro lado, c36m3pm tiene la mejor puntuación en el mapa de contacto intrapéptido pero una puntuación SSP deficiente. Los FF en el grupo de clasificación “intermedia” tienden a tener puntuaciones bajas en al menos una de las tres medidas, pero tienen un acuerdo medio en las restantes. Los detalles de las tres medidas se explicarán en las siguientes secciones.

La puntuación Rg mide la capacidad de los FF para muestrear estados compactos y desplegados de la región R2-FUS-LC. Los datos de referencia para el estado de la estructura β cruzada plegada comprenden dos conformaciones distintas de la región R2-FUS-LC: conformación en “forma de U” (PDB: 5W3N16) y conformación en “forma de L” (PDB: 7VQQ24), como se muestra en la Fig. 1. Ambas conformaciones forman una estructura β cruzada. Se resolvieron mediante RMN veinte modelos en forma de U con diferentes conformaciones de bucle con una Rg promedio de 10,0 Å (trímero de R2-FUS-LC) y la conformación en forma de L menos compacta (Rg: 14,4 Å) (trímero de R2-FUS-LC). LC) se resolvió mediante crio-EM. La reversibilidad de la estructura cruzada-β11,17 sugiere que la región R2-FUS-LC podría adoptar el estado desplegado. Para estimar la Rg del estado desplegado, empleamos el modelo de polímero de bobina aleatoria de Flory con parámetros optimizados para los desplazados internos43. Por lo tanto, tenemos tres medidas diferentes de Rg: Rg en forma de L, en forma de U y desplegada.

Las distribuciones de Rg para instantáneas de los datos de simulación se presentan en la Fig. 2 y la Fig. S4. Para evaluar con qué frecuencia los FF pueden generar conformaciones que se parecen mucho a las estructuras de referencia en términos de Rg, ajustamos las distribuciones de Rg con dos distribuciones gaussianas. La distancia desde la i-ésima media hasta la k'ésima referencia Rg se calculó como el número absoluto de desviaciones estándar (\({\text{Z-score}}_{FF,k,i}\)) de la i 'th gaussiano. Se eligió el \({\text{Z-score}}_{FF,k,i}\) más bajo, se invirtió y se normalizó escalándolo linealmente de 0,00001 a 1,0 (Tabla 2). La puntuación Rg final se calculó multiplicando las tres puntuaciones normalizadas y reescalándolas de la misma manera (Tabla 2).

Distribución del Radio de giro (Rg). Los dos FF mejor clasificados para la puntuación Rg final (Tabla 2) son C36m2021s3p (rojo) y c36ms3p (rosa). Estos FF pueden generar conformaciones compactas y extendidas que cubren tanto los Rg en forma de U como de L. Sin embargo, a14sb3p (verde) solo tomó muestras de conformaciones compactas (que se muestran en el recuadro para una vista ampliada). Por otro lado, c36m3pm (verde claro) generó conformaciones extendidas. Ambos FF se ubican en la parte inferior. La figura fue preparada con Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/).

Los trece FF se pueden dividir en tres grupos. Al comparar la clasificación de la puntuación final (Tabla 1) y la puntuación final de Rg (Tabla 2), los cuatro FF principales (c36m2021s3p, a99sb4pew, a19sbopc y c36ms3p) son los mismos, aunque el orden es ligeramente diferente.

Al analizar la Tabla 2, identificamos dos tipos distintos de FF entre los cuatro principales. El primer tipo incluye c36m2021s3p y a19sbopc, los cuales exhibieron un rendimiento consistente en los tres Rg de referencia. Por otro lado, el segundo tipo consta de c36ms3p y a99sb4pew, que demostraron preferencia por conformaciones flexibles y compactas, respectivamente. También observamos un sesgo hacia la Rg en forma de U en a99sb4pew, a99sbCufix3p y a14sb3p (Fig. S4), mientras que c36m2021s3pm y c36m3pm (Fig. S4) favorecieron la Rg desplegada. Sin embargo, vale la pena señalar que el rango Rg final de estos FF está inversamente correlacionado con la fuerza de su sesgo de las conformaciones muestreadas. Esto se debe a que nuestro esquema de puntuación penaliza a los FF que se ajustan bien a un solo Rg de referencia específico pero que tienen un mal desempeño en los demás. Como resultado, los dos FF de peor rendimiento son c36m3pm y a14sb3p (Fig. 2).

En general, los CHARMM FF tienden a generar conformaciones más extendidas que los AMBER FF (Figs. S3 y S4), excepto a03ws.

Rg es una medida de la compacidad global de una conformación, pero no es adecuada para evaluar los detalles de la conformación. Para evaluar las conformaciones muestreadas con más detalle, introdujimos dos medidas en las siguientes secciones: el mapa de contacto intrapéptido y la propensión a la estructura secundaria (SSP). Estas medidas evalúan las interacciones intrapéptidos.

Las conformaciones en forma de U y en forma de L contienen 20 y 15 contactos intrapéptidos, respectivamente (Fig. 3). En la conformación en forma de L, no se observaron contactos entre los residuos j y > j + 5 (contactos de media distancia) dentro de un límite de 5 Å. Sin embargo, en la conformación en forma de U, se encuentran contactos de media distancia entre Tyr50 – Tyr55, Tyr50 – Thr64, Tyr50 – Gly65, Tyr55 – Asn63 y Ser57 – Ser61. Por lo tanto, solo consideraremos la conformación en forma de U para evaluar los FF.

Mapa de contacto intrapéptido para conformaciones en forma de U (izquierda, PDB ID: 5W3N) y en forma de L (derecha, PDB ID: 7VQQ) con un límite de 5 Å. Los tipos de contacto están etiquetados por colores, donde "Sc" corresponde a Side Chain y "Bb" a Backbone. En ambas conformaciones, la mayoría de los contactos ocurren dentro de ± 3 residuos. La conformación en forma de U exhibe algunos contactos de media distancia, mientras que la conformación en forma de L carece de contactos de media distancia. La figura fue preparada con Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/).

Para cada una de las simulaciones de MD de los trece FF, calculamos los contactos intrapéptidos promedio para los trímeros en todas las instantáneas. Los contactos de los FF y la conformación en forma de U se compararon utilizando la puntuación del coeficiente de correlación de Matthews (MCC)45 (Tabla 3). La puntuación de MCC varía de -1 a 1, donde un valor de 1 indica una correlación perfecta, -1 indica una anticorrelación perfecta y 0 indica ninguna correlación. La puntuación de MCC penaliza las predicciones falsas, lo que significa que los FF que predijeron la mayor cantidad de contactos nativos (Verdaderos Positivos, TP), como a99sb4pew, c27s3p y a14sb3p (Tabla S2), pueden no ser necesariamente los FF con mayor puntuación (Tabla 3). El proceso de normalización se llevó a cabo de manera similar a lo descrito en el apartado anterior.

En el ranking de puntuación del mapa de contactos (Tabla 3), hay algunos resultados sorprendentes. A pesar de haber sido clasificados como de peor desempeño según la puntuación final (Tabla 1), los FF c36m2021s3pm y c36m3pm se clasificaron en la parte superior de la puntuación del mapa de contactos. Por otro lado, c36m2021s3p, que obtuvo la puntuación final más alta, solo ocupó el cuarto lugar. Además, a99sbCufix3p se ubicó en la parte inferior a pesar de tener una clasificación intermedia en la puntuación final.

Al examinar las matrices de confusión para los cuatro FF (Tabla 4 y Tabla S2), tenemos algunas observaciones. En primer lugar, c36m2021s3pm, c36m3pm y c36m2021s3p, que tienen las puntuaciones más altas de Unfolded Rg, tienden a favorecer conformaciones más extendidas. Esto es evidente por el hecho de que < 20% de los pares de residuos están en contacto. Por el contrario, a99sbCufix3p prefiere conformaciones más compactas, con un 23,16% de pares de residuos en contacto.

Vale la pena señalar que, si bien los CHARMM FF con conformaciones extendidas tienen menos contactos generales (Tabla 4, Total Pred. True), también tienen contactos no nativos significativamente más bajos (Tabla 4, en negrita). Por el contrario, a99sbCufix3p tiene más contactos en general, pero una mayor proporción de estos contactos no son nativos (Tabla 4). Después de excluir estos cuatro FF, se encontró que las clasificaciones de puntuación del mapa de contactos de los FF restantes (Tabla 3) eran consistentes con las clasificaciones de puntuación final (Tabla 1).

La conformación en forma de L consta principalmente de hebras β pero no forma láminas β dentro del péptido. Como resultado, sus conformaciones no pueden determinarse a partir de los mapas de contacto intrapéptido. Esto nos motiva a evaluar la propensión a la estructura secundaria (SSP) de estos FF en la siguiente sección.

En cada instantánea, se utiliza el Diccionario de estructura secundaria de proteínas (DSSP)46,47 para asignar el tipo de estructura secundaria (hélice α, hebra β o espiral) a cada residuo. Para cada residuo, definimos su SSP/probabilidad para todos los tipos de estructuras secundarias contando el número de ocurrencias en todas las instantáneas y dividiéndolo por el número total de instantáneas. Para evaluar el SSP de los FF para la región R2-FUS-LC, definimos la puntuación del SSP como la probabilidad logarítmica de observar las estructuras secundarias experimentales (en forma de U y en forma de L) dadas las distribuciones de probabilidad de SSP obtenidas de las instantáneas de simulación ( detalles en Métodos). La normalización se realizó de manera similar a la descrita anteriormente.

En la Tabla 5, observamos que la puntuación SSP es mayor para a14sb3p y a99sbCufix3p, pero menor para c36ms3p y c36m2021s3pm en comparación con su clasificación final. Los FF con puntuaciones SSP más altas tienden a producir conformaciones más compactas, como lo demuestran sus puntuaciones Rg (Tabla 2). Por el contrario, los FF con clasificaciones más bajas tienden a favorecer conformaciones más extendidas. Esto sugiere que la formación de estructuras secundarias nativas es necesaria para el desarrollo de fibrillas compactas.

Los FF a03ws y c27s3p, que tienen las puntuaciones de SSP más bajas, exhiben una fuerte tendencia a generar conformaciones con hélices α alrededor del motivo RAC2 (Fig. 4). Sin embargo, tanto en la conformación en forma de L24 como en la de U16, esta región forma hebras β. Los datos de desplazamiento químico de RMN también confirman la ausencia de hélices α en la región R2-FUS-LC16,17,18,22,48.

Propensión a la estructura secundaria de la hélice α (SSP). Datos experimentales de Murray et al. no indican propensión a la hélice α dentro de los 16 residuos. Solo se muestran los FF con una propensión a la hélice α por residuo superior a 0,1. Todos los FF, excepto a14sb3p (segundo clasificado), se encuentran en la parte inferior del rango SSP (Tabla 5). A pesar de tener una pequeña cantidad de SSP de hélice α, a14sb3p tiene una clasificación de SSP alta debido a su alto SSP de cadena β (Fig. S5). La figura fue preparada con Matplotlib v3.544 (https://matplotlib.org/).

Nuestra observación indica que los FF AMBER, específicamente a14sb3p y a99sbCufix3p, generan conformaciones más compactas en comparación con los FF CHARMM, c36ms3p y c36m2021s3pm, que tienden a producir conformaciones más extendidas. Los FF que tienen conformaciones más extendidas pueden replicar mejor las propiedades de las conformaciones en forma de U y L en comparación con los FF que generan conformaciones más compactas que se ajustan bien solo a una de estas conformaciones.

Tanto los FF AMBER como los CHARMM no reproducen adecuadamente las interacciones entre péptidos necesarias para formar fibrillas (Tabla S3), aunque los FF AMBER funcionan relativamente mejor que los FF CHARMM. La preferencia de los CHARMM FF por conformaciones extendidas se extiende a sus interacciones entre péptidos: los péptidos pasan aproximadamente la mitad del tiempo como dímeros o monómeros en contraste con los AMBER FF (excepto a03ws) que permanecen principalmente como trímeros (Tabla S4). Las puntuaciones de interacción entre péptidos no se incluyeron en la puntuación final ya que todos los FF funcionan mal y solo agregarían ruido a la clasificación final.

En nuestro estudio, el tiempo de muestreo limitado (sólo 3 µs) puede haber contribuido al bajo rendimiento observado. La formación de fibrillas suele ocurrir en un período de tiempo mucho más largo, de horas a días16,24. Para aliviar pero no resolver este problema, hemos aumentado la concentración de péptidos de 0,16 mM (como se usa en la determinación de la estructura por RMN16) a 10 mM disminuyendo la relación entre el número de péptidos y el número de moléculas de agua (agregue más agua) e iniciamos Simulaciones de la conformación en forma de U en forma de fibrilla. Una mayor concentración de péptidos FUS aumenta la posibilidad de que estos péptidos interactúen entre sí y formen fibrillas. Además, observamos que la mayoría de las simulaciones de FF casi han convergido dentro de 300 ns al monitorear los valores promedio de Rg a lo largo del tiempo (Fig. S6).

Es posible que el fragmento elegido no sea capaz de formar fibrillas de forma independiente. Para investigar esta posibilidad, analizamos las interacciones intraproteicas del dominio LC de longitud completa (residuos 1 a 214). Los mapas de contacto muestran que existen contactos limitados a larga distancia entre las regiones R2-FUS-LC y el resto de la proteína en las conformaciones en forma de U/L (Fig. S2), lo que indica que la región R2-FUS-LC funciona. como un dominio distinto dentro del dominio LC más grande, al menos en la fibrilla.

Nuestro estudio corrobora investigaciones previas realizadas por Lao et al. quienes utilizaron el modelo de agua a99sbildn4pd con TIP3P en lugar de TIP4PD para simular una región más larga de FUS que incluía la región R2-FUS-LC23. Nuestros hallazgos muestran patrones de mapas de contacto similares a los de su estudio, y también observamos una propensión de ~ 5% de las hélices α, lo que es consistente con su trabajo. Sin embargo, notamos una discrepancia en la propensión a la cadena β entre nuestro estudio y el de ellos, y su estudio observó una propensión a la cadena β mucho mayor que la nuestra (Fig. S5). Esta diferencia se puede atribuir a la longitud del péptido utilizado en cada estudio, ya que su estudio utilizó una longitud de péptido de 60 residuos en comparación con la longitud de 16 residuos de nuestro estudio.

Nuestros hallazgos también son consistentes con otros estudios sobre proteínas β-amiloide, donde diferentes FF produjeron diferentes conjuntos conformacionales, algunos de los cuales son compatibles con la agregación de fibrillas42,49,50. Por ejemplo, Pedersen et al. encontraron que a19sbopc produce conformaciones más compactas y forma más cadenas β que a99disp49, mientras que Samantray et al. El c36ms3p demostrado dio resultados prometedores para el muestreo y la obtención de conjuntos conformacionales con estructuras de hebras β y bobinas aleatorias50. Finalmente, nuestra clasificación de puntuación final es la misma que la de los resultados del péptido β-amiloide (Aβ40) de Robustelli et al. lo que demuestra que c36ms3p es el mejor, excepto c22s3p que superó a a99disp y a99sbildn4pd en nuestro ranking27. Además, también observaron que c22s3p y a03ws sobreestiman la propensión a la hélice α (Fig. 4).

Además, nuestros resultados son consistentes con Piana et al., quienes probaron modelos de agua de tres y cuatro sitios con AMBER y CHARMM FF42. Cuando se utilizó el modelo de agua TIP3P (3 sitios), se encontró que los FF CHARMM eran más flexibles que los FF AMBER, y cuando se usaron modelos de agua de 4 sitios, los FF AMBER se volvieron mucho más flexibles, a excepción de a99sb4pew (Fig. S4).

En este estudio, investigamos la efectividad de los campos de fuerza desarrollados para proteínas globulares y sus versiones modificadas para proteínas intrínsecamente desordenadas. Descubrimos que estos campos de fuerza, con sus modelos de agua adaptados, producen conjuntos conformacionales distintos. Nuestros resultados resaltan la importancia de utilizar múltiples medidas para una evaluación integral de los campos de fuerza debido a la flexibilidad intrínseca de este sistema que puede formar fibrillas de cadena β y adoptar conformaciones enrolladas aleatorias.

Nuestra evaluación de trece campos de fuerza de las familias CHARMM y AMBER reveló que c36m2021s3p es el más equilibrado en términos de las tres medidas utilizadas. Este campo de fuerza puede generar varias conformaciones que son compatibles con las conformaciones en forma de U/L, y mostró una buena concordancia en términos del SSP y el mapa de contacto intrapéptido. Además, su modelo de agua mTIP3P es computacionalmente menos costoso que los de los AMBER FF de primer nivel con modelos de agua de cuatro sitios.

Se han resuelto múltiples estructuras 3D del dominio FUS-LC mediante cristalografía de rayos X17,51, cristalografía electrónica17,52, microscopía crioelectrónica (crio-EM)24 y RMN16. Los detalles de las estructuras se enumeran en la Tabla S5.

De los 20 modelos de RMN en forma de U (PDB ID: 5W3N16), se utilizó la región de los residuos 50–65 (región R2-FUS-LC, Fig. 1, cuadrado rojo) de las tres primeras cadenas (trímero). Las 20 estructuras se agruparon en seis grupos utilizando la herramienta GROMACS gmx cluster53 con un límite de RMSD de 1,7 Å (solo Cα). Las seis estructuras representativas se utilizaron para ejecutar seis simulaciones MD independientes.

Las simulaciones de MD de todos los átomos se realizaron utilizando GROMACS 2020.454,55. Las seis conformaciones iniciales de R2-FUS-LC (663 átomos) se solvataron en una caja cúbica de 80 × 80 × 80 Å3. Para replicar las condiciones del experimento de RMN22, se agregaron iones NaCl 137 mM (~ 17.000 moléculas de agua). Los sistemas finales contienen entre 52.000 y 68.000 átomos.

Los 13 campos de fuerza (FF) de IDP y sus correspondientes modelos de agua (WM) (detalles en la Tabla S1 y en la sección de información complementaria Punto de referencia de campos de fuerza (FF) y modelos de agua (WM)): a03ws, a14sb3p, a19sbopc, a99disp, a99sb4pew, a99sbCufix3p, a99sbildn4pd, c22s3p, c27s3p, c36m2021s3p, c36m2021s3pm, c36m3pm y c36ms3p.

El límite no adherido se establece en 12 Å. Las interacciones electrostáticas se trataron con el método de Ewald de malla de partículas lisas56 para interacciones de largo alcance y de Coulomb para interacciones de corto alcance. Para los FF CHARMM, el potencial de Lennard-Jones se modifica mediante la función de conmutación de fuerza de GROMAC54,55 entre 8 y 12 Å.

La longitud de los enlaces covalentes de soluto y agua que involucran átomos de hidrógeno se mantuvo constante utilizando los algoritmos LINCS57 y SETTLE58, respectivamente, lo que permitió la integración de ecuaciones de movimiento con un paso de tiempo de 2 fs.

Para cada sistema, se realizó una minimización de energía seguida de una ejecución de equilibrio de presión y temperatura constantes (NPT) de 1 ns a 1 bar y 300 K. La temperatura se controla mediante el termostato de reescala V y la presión mediante el barostato Berendsen59,60 con el acoplamiento de tiempo. constantes τT = 0,1 ps y τP = 0,5 ps, respectivamente. Se realizó una segunda serie de equilibrio con un termostato Nose-Hoover y un barostato Parrinello-Rahman61,62,63 con las constantes de acoplamiento de tiempo τT = 0,5 ps y τP = 2,5 ps durante 1 ns.

Para la ejecución de producción, cada uno de los seis sistemas se simuló durante 500 ns en las mismas condiciones que en la segunda ejecución de equilibrio, pero con una velocidad aleatoria. Las instantáneas se guardaron cada 20 ps. Los primeros 100 ns de la ejecución de producción se descartaron y los 400 ns restantes se utilizaron para análisis posteriores.

El protocolo anterior se aplicó a cada uno de los 13 campos de fuerza, dando una trayectoria acumulada de 3 μs.

El análisis de las instantáneas se realizó con MDAnalysis64,65, MDtraj66, DSSP46,47 y nuestros propios scripts. Todas las figuras se trazaron con Matplotlib44 (módulo Python).

Todas las puntuaciones brutas se redimensionaron linealmente de modo que estén entre 0,0001 y 1 mediante:

donde \({S}_{norm,\mathrm{FF}}\) y \({S}_{raw,\mathrm{FF}}\) son las puntuaciones normalizadas y brutas para un campo de fuerza específico (FF) , respectivamente.

Para cada instantánea, el radio de giro (Rg) de los átomos pesados del trímero de 16 residuos y los péptidos individuales se calcularon con MDAnalysis.

La distribución Rg del trímero (Fig. 2 y Fig. S4) se ajustó a dos gaussianos utilizando el modelo de mezcla gaussiana.

Para evaluar los FF, el \({\text{Rg-Score}}_{FF,k}\) (puntuación bruta) compara los resultados de la simulación con el \({Rg}_{exp,k}\) experimental de k (en forma de U [promedio de 20 modelos]: 10 Å o en forma de L: 14,4 Å). Se calcula como:

donde \(\langle {Rg}_{FF,i}\rangle \) y \({SD}_{FF,i}\) son el promedio y la desviación estándar, respectivamente, del iésimo gaussiano.

La Rg de los péptidos individuales se comparó con la \(R{g}_{FL}\) predicha (10,8 Å) de la teoría del polímero de Flory con parámetros optimizados para los desplazados internos por Bernado y Blackledge43:

donde \({R}_{0}=\) 2.54 Å es la longitud de persistencia, ν = 0.522 es el factor de escala exponencial, N es el número de residuos, \(R{g}_{FF,med}\) es la mediana Rg del FF y q3 y q1 son el percentil 75 y 25, respectivamente.

Se normalizaron las puntuaciones brutas de (2) y (3). La puntuación Rg final es el producto normalizado de la Rg normalizada en forma de U, en forma de L y desplegada (Tabla 2).

Para analizar los contactos de los átomos pesados en cada péptido, desarrollamos un código personalizado para generar mapas de contactos. Un contacto se definió como dos átomos que se encuentran a una distancia de 5 Å, excepto los residuos vecinos a lo largo de la secuencia de proteínas. Contamos los contactos intrapéptidos en todas las instantáneas y filtramos las frecuencias de contacto <1%. Luego se calcularon las frecuencias de contacto promedio en los tres péptidos.

Al comparar el mapa de contactos promedio de cada instantánea con la conformación representativa en forma de U (Fig. 3), los contactos se clasificaron en uno de cuatro grupos [Tabla 6; Verdadero(T)/Falso(F) Positivo(P)/Negativo(N)]. Un contacto (sin contacto) se considera positivo (negativo). Los contactos de todas las instantáneas de las seis réplicas se acumularon en la matriz de confusión (Tabla S2).

Se utilizó el coeficiente de correlación de Matthews (MCC)45 para medir la concordancia de los mapas de contactos:

Tenga en cuenta que la puntuación de MCC está entre − 1 y 1. Una puntuación de MCC de 1 muestra una correlación perfecta con la referencia, 0 sin correlación y − 1 con correlación perfectamente negativa. Luego, la puntuación bruta de MCC se normaliza para obtener la puntuación normalizada del mapa de contacto intrapéptido (Tabla 3).

Clasificamos la conformación del péptido en cada instantánea como monómero, dímero o trímero según sus contactos con otros péptidos (Tabla S4). Se definió que el monómero no tenía contacto con otros péptidos, mientras que el dímero tenía exactamente dos péptidos en contacto. El trímero se caracterizó por estar cada péptido en contacto con otro péptido. Se considera que dos péptidos están en contacto si tienen al menos un contacto. Utilizamos la misma definición de contacto que en el análisis intrapéptido.

Para identificar el péptido medio en los trímeros, determinamos el péptido con los contactos interpeptídicos más altos en la fibrilla. Luego comparamos el mapa de contacto calculado con el mapa de contacto experimental del péptido medio con uno de los otros dos péptidos.

Para las estructuras experimentales, los mapas de contacto del péptido medio con cualquiera de los péptidos de borde fueron similares, por lo que elegimos la cadena AB para comparar con los mapas de contacto calculados (ver Fig. S7). Se utilizó el mismo mapa de contactos para los dímeros.

Todos los contactos entre dos péptidos de borde en los conjuntos se consideraron falsos positivos (FP). Empleamos el mismo método que en la sección anterior para clasificar los contactos y calcular las puntuaciones del coeficiente de correlación de Matthews (MCC) (Tabla S3).

Para asignar estructuras secundarias, utilizamos el Diccionario de Estructura Secundaria de Proteínas (DSSP)46,47. Cada residuo se clasificó como hélice α (H), cadena β (E) o espiral (C).

La propensión/probabilidad de la estructura secundaria de cada residuo (\({p}_{i,ss}\), SSP) se calcula a partir de las instantáneas, combinando los datos de los tres péptidos del mismo FF:

donde: i es la posición del residuo en el péptido j en la instantánea t de la simulación realizada con el campo de fuerza. ssi,j,t es 1 cuando DSSP le asigna el tipo de estructura secundaria respectivo ss o 0 en caso contrario. ss representa el tipo de estructura secundaria: hélice α (H), hebra β (E) o bobina (C).

Las estructuras secundarias de referencia se obtuvieron de las estructuras en forma de U (20 modelos) y en forma de L (estructura única), como se muestra en la Tabla S6. La puntuación de la estructura secundaria del FF con respecto a la estructura experimental k (en forma de U/L) es:

donde i representa la posición del residuo y \({exptl}_{k,i}\) es la estructura secundaria del residuo i en la estructura experimental k.

Para cada FF, el SSP-Score es la probabilidad logarítmica de observar las estructuras secundarias experimentales. Derivamos las probabilidades de las propensiones observadas en las simulaciones, suponiendo que las posiciones son independientes entre sí.

Las puntuaciones SSP de FF sin procesar para las conformaciones en forma de U y L se renormalizaron de forma independiente. Tomamos el producto de estas dos puntuaciones SSP normalizadas y las volvimos a normalizar para obtener la puntuación SSP final (Tabla 5).

Utilizando los tres puntajes Rg normalizados, el puntaje SSP y el puntaje MCC intrapéptido, calculamos el puntaje final para cada FF multiplicando los puntajes y volviendo a normalizar el producto (Tabla 1).

Datos disponibles previa solicitud razonable a HK.

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Descargar referencias

Las simulaciones de MD se realizaron utilizando recursos JAEA del instituto QST y recursos locales. Este trabajo fue apoyado por la beca JSPS 2020 (beca posdoctoral JSPS para investigación en Japón (corto plazo) para MC). Este trabajo también fue apoyado en parte por KAKENHI (JP18H05534), MEXT como “Programa para promover investigaciones en la supercomputadora Fugaku” (dinámica biomolecular en una célula viva, JPMXP1020200101, hp220177) y la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) (23ama121024j0002 ).

Maud Chan-Yao-Chong

Dirección actual: Instituto de Biotecnología de Toulouse, TBI, Universidad de Toulouse, CNRS, INRAE, INSA, 135, Avenue de Rangueil, 31077, Toulouse Cedex 04, Francia

Equipo de simulación y modelado molecular (MMS), Instituto de ciencias biológicas cuánticas, Institutos nacionales de ciencia y tecnología cuánticas (QST), 4-9-1, Anagawa, Inage Ward, ciudad de Chiba, Chiba, 263-8555, Japón

Maud Chan-Yao-Chong, Justin Chan y Hidetoshi Kono

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MC, JC y HK planificaron el proyecto de investigación. MC llevó a cabo todas las simulaciones. MC y JC analizaron los datos. MC, JC y HK escribieron y revisaron el texto manuscrito. El manuscrito fue escrito gracias a las contribuciones de todos los autores. Todos los autores han dado su aprobación a la versión final del manuscrito. Estos autores contribuyeron igualmente.

Correspondencia a Hidetoshi Kono.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chan-Yao-Chong, M., Chan, J. y Kono, H. Evaluación comparativa de campos de fuerza para caracterizar la región R2-FUS-LC intrínsecamente desordenada. Informe científico 13, 14226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40801-6

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Recibido: 26 de diciembre de 2022

Aceptado: 16 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40801-6

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Evaluación comparativa de campos de fuerza para caracterizar el R2 intrínsecamente desordenado