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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1418 (2023) Citar este artículo

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Los hongos filamentosos multicelulares tienen poros septales que permiten el intercambio citoplasmático y, por tanto, la conectividad entre las células vecinas del filamento. Las heridas hifales y otras condiciones de estrés inducen el cierre de los poros septales para minimizar la pérdida citoplasmática. Sin embargo, no se comprenden bien la composición del poro septal y los mecanismos subyacentes a su función. Aquí, nos propusimos identificar nuevos componentes septales determinando la localización subcelular de 776 proteínas no caracterizadas en un ascomiceto multicelular, Aspergillus oryzae. El conjunto de 776 proteínas no caracterizadas se seleccionó sobre la base de que sus genes estaban presentes en los genomas de ascomicetos multicelulares con poros septales (tres especies de Aspergillus, en la subdivisión Pezizomycotina) y ausentes/divergentes en los genomas de ascomicetos que carecen de poros septales ( levaduras). Al determinar su localización subcelular, se encontró que 62 proteínas se localizaban en el tabique o el poro septal. La eliminación de los genes codificantes reveló que 23 proteínas participan en la regulación del taponamiento de los poros septales tras la herida de las hifas. Así, este estudio determina la localización subcelular de muchas proteínas no caracterizadas en A. oryzae y, en particular, identifica un conjunto de proteínas implicadas en la función del poro septal.

El surgimiento de la multicelularidad representa una transición importante en la historia evolutiva. Organismos de diversos orígenes se han organizado en morfologías multicelulares simples, como filamentos, racimos y láminas, donde la comunicación intercelular es limitada debido a la falta de pasajes directos en la población celular posterior1,2. En la historia evolutiva relativamente tardía, varios grupos de organismos eucariotas han desarrollado una multicelularidad compleja a través de la adhesión célula-célula y programas de desarrollo para diferenciarse en tejidos, órganos reproductivos y cuerpos fructíferos1,3. Además, los organismos multicelulares complejos han desarrollado una conectividad de célula a célula a través de conductos ultraestructurales para facilitar la transmisión de señales4,5,6. Esta conectividad entre células ha evolucionado de forma independiente en animales, plantas y hongos multicelulares; además, su regulación confiere ventajas selectivas en entornos desfavorables. En los animales, las uniones comunicantes, que permiten el paso de iones y moléculas pequeñas, se ven perturbadas estructural y funcionalmente por el estrés oxidativo7. En las plantas, los plasmodesmos, que median el tráfico de factores de transcripción y moléculas de señalización de célula a célula, pueden bloquearse mediante la deposición de callosa en respuesta al estrés8.

Los hongos incluyen especies que contienen poros septales (hongos filamentosos) y especies que carecen de ellos (levaduras), lo que facilita la caracterización de la organización relacionada con los poros septales basada en comparaciones. Las hifas de los hongos crecen extendiendo puntas polarizadas y se compartimentan aún más con los septos en relación con el tamaño celular y la división nuclear9. En el centro del tabique se encuentra un poro septal que permite el intercambio de constituyentes citoplasmáticos entre las células flanqueantes10,11. En el subfilo Pezizomycotina de Ascomycota, estos poros pueden ser taponados por el cuerpo Woronin específico del hongo, derivado de peroxisomas12. Por el contrario, las especies del subfilo Agaricomycotina de Basidiomycota han desarrollado una tapa de poro septal (SPC) derivada del retículo endoplásmico para bloquear los poros13,14. Un mutante que carecía de la proteína de la matriz corporal Woronin, Hex1, exhibió una gran pérdida de citoplasma de las células flanqueantes a través de los poros septales tras la herida de las hifas12.

La función de los poros septales se regula dinámicamente en respuesta a condiciones mecánicas, ambientales y fisiológicas. Estreses como la baja temperatura y el bajo pH reducen la conectividad entre células a través de mecanismos desconocidos10,11. Las heridas hifales y el estrés abiótico inducen la acumulación de proteínas asociadas al poro septal (SPA) y la proteína SO (o SOFT) en el poro15,16,17. Además, el poro se cierra transitoriamente durante la mitosis y se abre durante la interfase cuando la Nima quinasa, un regulador del ciclo celular, se mueve desde el núcleo al poro septal18. Los poros septales también están modulados por condiciones fisiológicas como la edad de las hifas11,19, lo que sugiere la participación de componentes adicionales en la regulación de sus funciones. Teniendo en cuenta estos comportamientos dinámicos de la regulación de los poros septales, falta nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes, especialmente dado el conocimiento limitado de la función corporal de Woronin.

Se propone que las hifas, la firma de la multicelularidad fúngica, evolucionaron temprano en la evolución fúngica, posiblemente en hongos divergentes tempranas como Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Zoopagomycota y Mucoromycota20. Utilizando una comparación genómica a gran escala, Kiss et al. propusieron un conjunto de genes implicados en la morfogénesis de las hifas que se comparten entre clases de hongos independientemente de la presencia o ausencia de hifas filamentosas20. Además, mientras que las especies de hongos dentro de Pezizomycotina y Agaricomycotina suelen mostrar una ganancia sustancial de familias de genes, como lo ejemplifican las complejidades morfológicas como el poro septal, las levaduras muestran una mayor tasa de pérdida de genes20,21. Generalmente se considera que la morfología de las hifas es la base de la multicelularidad fúngica, mientras que la aparición y regulación del poro septal han evolucionado de forma independiente en linajes multicelulares, lo que confiere mayores complejidades morfológicas. Sin embargo, estos pasos evolutivos en la aparición y regulación de los poros septales siguen siendo poco conocidos.

Aquí, combinamos comparaciones genómicas entre ascomicetos que contienen y carecen de poros septales con detección de localización a gran escala de proteínas candidatas de poros septales para identificar nuevos componentes septales. Encontramos que el poro septal es un foco de localización de las proteínas implicadas en su regulación dinámica. Utilizando un enfoque bioinformático que incluye análisis filogenéticos extensos, dilucidamos los patrones de evolución genética involucrados en el taponamiento de los poros septales tras la herida de las hifas.

En este caso, se utilizó Aspergillus oryzae debido a la disponibilidad de técnicas experimentales avanzadas para cuantificar la obstrucción de los poros septales tras la herida de las hifas inducida por un shock hipotónico, así como para cuantificar la conectividad entre células tras el estrés por frío utilizando proteínas fluorescentes fotoconvertibles10,16,19. 22,23. El genoma de A. oryzae se comparó con el de los ascomicetos que contienen poros septales A. nidulans, A. fumigatus y Neurospora crassa (Pezizomycotina), así como con los ascomicetos que carecen de poros septales Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans (Saccharomycotina) y Schizosaccharomyces pombe ( Taphrinomycotina) usando BLASTp (Fig. 1a). Primero, se compararon las proteínas que se sabe que funcionan en la morfogénesis celular (codificadas por 243 genes que tienen ortólogos en A. fumigatus20) (Datos complementarios 1a). La mayoría de las proteínas de las especies que contienen poros septales mostraron homologías de secuencia más altas (Fig. 1a, burbuja azul en el gráfico de burbujas superior), y un número considerable de proteínas también exhibieron homologías de secuencia con proteínas de las especies que carecen de poros septales (Fig. 1a, burbujas rojas y azules en el gráfico de burbujas superior). Esto sugirió que los genes relacionados con la morfogénesis celular evolucionaron antes de su divergencia. De manera similar, analizamos proteínas que se sabe que funcionan en la regulación de los poros septales (Datos complementarios 1b basados ​​en informes anteriores15,16,17,23,24). La mayoría de estas proteínas mostraron homologías nulas o limitadas con proteínas de las especies que carecen de poros septales (Fig. 1a, burbuja verde en el gráfico de burbujas inferior), mientras que muchas exhibieron homologías de secuencia con las especies que contienen poros septales (Fig. 1a, burbuja azul). en el gráfico de burbujas inferior). Este resultado sugirió que estas proteínas surgieron en el linaje que condujo a Pezizomycotina, pero se perdieron o divergieron en las levaduras ascomicetas. A continuación, para analizar más ampliamente la conservación de genes codificadores de proteínas, comparamos conjuntos de datos proteómicos completos de las especies antes mencionadas con el proteoma de A. oryzae. Se encontró una gran cantidad de proteínas con homologías de secuencia más altas dentro de las especies que contienen poros septales, pero se encontró un número menor en las especies que carecen de poros septales (Fig. 1a, barra azul en el gráfico de barras). Esta tendencia de conservación es similar a la obtenida en el análisis comparativo utilizando las proteínas involucradas en la regulación del poro septal (Fig. 1a, gráfico de burbujas inferior). Con base en estos hallazgos, planteamos la hipótesis de que las proteínas involucradas en la regulación de los poros septales podrían estar conservadas en las especies que contienen poros septales, pero ausentes o divergentes en las especies que carecen de poros septales.

una comparación genómica basada en BLASTp entre los ascomicetos que contienen y carecen de poros septales. Los dibujos superiores de hifas muestran la morfología de las hifas, y los dibujos inferiores de hifas con septos perforados indican el poro septal y su regulación. El tamaño de la burbuja es proporcional a la cantidad de proteínas conocidas involucradas en la morfogénesis celular (gráfico de burbujas superior, Datos complementarios 1a) y la regulación de los poros septales (gráfico de burbujas inferior, Datos complementarios 1b). En el gráfico de barras, el eje Y representa el número total de genes codificadores de proteínas por genoma analizado. Los colores en burbujas y barras representan las proteínas dentro de los valores BLASTp e analizados; azul, rojo y verde indican rangos de valores de BLASTp e ≤1,0e-100, ≤1,0e-30 (>1,0e-100) y >1,0e-30, respectivamente. b Estrategia para la selección de proteínas candidatas del poro septal.

Para seleccionar proteínas candidatas del poro septal, buscamos genes conservados en los ascomicetos que contienen poros septales A. oryzae, A. fumigatus y A. nidulans (valores e ≤1,0e-100 en BLASTp), pero ausentes o divergentes en el poro septal. ascomicetos carentes de poros S. cerevisiae, C. albicans y S. pombe (valores de e ≥1.0e-30 en BLASTp) (Fig. 1b). En total, se identificaron 2.130 genes como candidatos potenciales. Estos genes se utilizaron además para seleccionar candidatos no caracterizados para los cuales no hay datos biológicos disponibles con respecto a ningún término de ontología genética (GO); función molecular, componente celular y proceso biológico (Fig. 1b). En consecuencia, finalmente se seleccionó un subconjunto de 776 genes candidatos no caracterizados para proteínas del poro septal (Datos complementarios 2).

Las secuencias de genes candidatos se recuperaron de la base de datos del genoma de Aspergillus AspGD (actualmente cerrada, pero el conjunto de datos está disponible en la base de datos FungiDB; https://fungidb.org/fungidb/app). Como se informó en análisis globales anteriores de localización de proteínas en levaduras en gemación25 y fisión26, cada uno de los 776 genes candidatos se fusionó con egfp en su extremo 3 'bajo el control del promotor amyB inducible27 (Fig. 2a). Los casetes de expresión se insertaron ectópicamente en el locus niaD de la cepa NSlD110 de A. oryzae mediante recombinación homóloga (Fig. 2a y Datos complementarios 3: Lista de cepas).

a Esquema del casete de expresión para fusiones EGFP de proteínas seleccionadas que se insertarán en el genoma de A. oryzae. b Localizaciones subcelulares de las 776 proteínas. Se muestran micrografías de fluorescencia confocal representativas de categorías de localización; las flechas indican septos. Barra de escala, 5 μm.

De las 776 cepas resultantes, detectamos fluorescencia de EGFP en las hifas vivas de 687 (88,5%) cepas (Fig. 2b). Luego, sus patrones de localización se clasificaron en cinco categorías: tipo orgánulo, citoplasmático, periférico, punta de hifa y tabique / poro septal (Fig. 2b). En total, 314 (40,5%) proteínas que se localizan predominantemente como estructuras esféricas, redes y puntos que se asemejan a orgánulos celulares se clasificaron como localización "similar a orgánulos" (Fig. 2b y Fig. 1 complementaria). Se observó tinción citoplasmática difusa y uniforme para 288 (37,1%) proteínas, mientras que 30 (3,9%) exhibieron localización periférica (Fig. 2b y Figs. Suplementarias 2 y 3a). Sin embargo, muchas de las proteínas periféricas se superpusieron con distribuciones similares a orgánulos (Figura complementaria 3a), probablemente debido a su presencia en la vía secretora. Diecinueve de las proteínas localizadas periféricamente contenían péptidos señal y/o dominios transmembrana (Figura complementaria 3a), lo que respalda esta hipótesis. Dieciocho (2,3%) proteínas localizadas en la punta de la hifa (Fig. 2b y Fig. Suplementaria 3b), mientras que las 89 proteínas restantes (enumeradas en Datos complementarios 4) no produjeron señales de EGFP detectables.

Es importante destacar que 62 proteínas (8,0%) se localizaron en el tabique o el poro septal (Fig. 2b). Cuarenta y nueve de estos eran septales en condiciones de crecimiento normales (Fig. 3a, by Fig. Suplementaria 4a-c), y los 13 restantes se acumularon en el poro septal tras la herida de las hifas (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 4d). Curiosamente, cinco proteínas septales tenían distribuciones superpuestas con las de la categoría de punta de hifa (Figura complementaria 3b), lo que sugiere redes reguladoras compartidas entre el tabique y la punta de hifa.

Los septos apicales de las cepas que expresan proteínas fusionadas con EGFP se analizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal en condiciones normales de crecimiento de control y tras herida de hifas. Los dibujos animados representan las categorías de patrones de localización observadas en el tabique. a Localización alrededor del poro septal. b Localización a ambos lados del tabique. c Acumulación de proteínas SPP no septales en el poro septal tras la herida de las hifas inducida por un shock hipotónico. Las flechas blancas indican los septos y las puntas de flecha rojas indican la acumulación de poros septales. Barras de escala, 5 μm.

En conjunto, nuestra estrategia de detección basada en bioinformática nos permitió encontrar muchas proteínas que muestran una localización relacionada con el tabique.

De las 62 proteínas septales, más tarde descubrimos que 23 estaban funcionalmente involucradas en la obstrucción del poro septal tras la herida de las hifas (ver Fig. 4b) y las designamos como proteínas de obstrucción del poro septal (SPP) con un orden alfabético de importancia funcional en el poro septal. actividad de taponamiento (Fig. 4b).

a Esquema que muestra el estallido de la punta de las hifas inducido por un shock hipotónico. Los dibujos animados y las imágenes DIC muestran hifas heridas capaces (arriba) o incapaces (abajo) de proteger las células adyacentes de la pérdida citoplasmática. Barras de escala, 5 μm. b Protección de las células flanqueantes contra la pérdida excesiva de citoplasma tras la herida de las hifas. En cada experimento se observaron treinta hifas seleccionadas al azar que mostraban estallido de la punta de las hifas. Se realizaron tres experimentos independientes y en el eje Y se muestra el porcentaje de hifas protegidas de la pérdida excesiva de citoplasma. Los datos se presentan como la media de experimentos repetidos y las barras de error representan desviaciones estándar. La significación estadística se probó mediante la prueba t de Student de dos colas: *P < 0,05, **P < 0,01. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c Localización de SppA en el sitio de formación del tabique. Las cepas se cultivaron durante 8 h en medio líquido CD (2% de glucosa) suplementado con 1% de casaminoácidos. El tiempo se indica en minutos. Las flechas blancas indican septos. Barras de escala, 5 μm. d Formación de tabique incompleta en ΔsppA visualizada usando FM4-64. Las flechas blancas indican septos. Barras de escala, 5 μm. e Componentes citoplasmáticos filtrados en ΔsppA tras el estallido de la punta de la hifa inducido por un shock hipotónico. Las puntas de flecha blancas indican constituyentes citoplasmáticos filtrados en la punta de las hifas. Barras de escala, 20 μm. f Anclaje anormal de los cuerpos de Woronin al tabique incompleto en ΔsppA. Se muestran imágenes de fluorescencia confocal únicas en los tabiques apicales. Las flechas blancas indican septos. Barras de escala, 5 μm.

En condiciones de crecimiento normal, se clasificaron 49 proteínas en tres categorías según sus localizaciones septales: (1) alrededor del poro septal (Fig. 3a y Fig. 4a complementaria), (2) en ambos lados del tabique (Fig. 3b y Fig. 4a complementaria) Fig. 4b), y (3) a lo largo del tabique (Fig. 4c complementaria).

La primera categoría se dividió en dos subgrupos: localización en forma de anillo, como dos puntos alrededor del poro septal bajo microscopía confocal (26 proteínas); y localización focal en el centro del poro septal (ocho proteínas) (Fig. 3a y Fig. complementaria 4a).

Trece proteínas estaban presentes en ambos lados del tabique cerca del poro septal, similar a la ubicación del cuerpo de Woronin (Fig. 3b y Fig. Suplementaria 4b). SppF y SppM mostraron una localización puntiforme en ambos lados, paralela al poro septal. Sin embargo, las proteínas restantes en esta categoría se localizaron ampliamente en ambos lados con múltiples puntos (Fig. 3b y Fig. Suplementaria 4b). SppF-EGFP colocalizado con la proteína de la matriz corporal Woronin etiquetada con mCherry AoHex1 en el tabique y en el citoplasma (Figura complementaria 5a). Sin embargo, la localización del cuerpo de Woronin en el tabique fue independiente de SppF (Figura complementaria 5b). Se localizaron dos proteínas en la tercera categoría, a lo largo del tabique, pero no periféricamente a lo largo de las hifas (Figura complementaria 4c).

La matriz interconectada de células hifales es vulnerable a lesiones mecánicas, causando una pérdida extensa de citoplasma en ausencia de obstrucción de los poros septales10,12,16,22,23. Varias proteínas citoplasmáticas se acumulan en el poro septal al producirse una herida10,15,16. Por lo tanto, las 776 cepas que expresan fusión de EGFP fueron sometidas a lesión hifal inducida por choque hipotónico10,16,22,23. Curiosamente, se descubrió que 13 proteínas que muestran localizaciones citoplasmáticas (cinco proteínas), similares a orgánulos (cuatro proteínas) y en la punta de las hifas (cuatro proteínas) en condiciones de crecimiento normales se acumulan en el poro septal al lesionarse (Fig. 3c y Fig. Suplementaria 4d). ). Además, SppI, SppT y SppL, que se localizaron alrededor del poro septal, así como SppO y SppF, que se localizaron en ambos lados del tabique en condiciones de crecimiento normal, mostraron una localización concentrada en el poro septal al momento de la herida (Figura complementaria 4e). . Los resultados las destacaron como proteínas candidatas con funciones en respuesta a las heridas, como se informó para las proteínas que acumulan los poros septales15,16,17.

En animales, las heridas mecánicas inducen la remodelación dinámica de la función de la membrana mediante mecanismos que incluyen la fusión de vesículas secretoras a la membrana plasmática para promover la curación28. Pezizomycotina emplea el cuerpo de Woronin para tapar el poro septal al producirse una herida12. Aquí, se analizó la actividad de obstrucción de los poros septales después de la eliminación de 62 genes candidatos reemplazándolos con el marcador seleccionable pyrG. Cuatro eliminaciones mostraron un crecimiento de colonias reducido (Figura complementaria 6a). Luego, las cepas de deleción se sometieron a un shock hipotónico, lo que provoca una herida en la punta de la hifa (Fig. 4a) 10,16,22,23. Las hifas protegidas de la pérdida citoplasmática excesiva de las células adyacentes se contaron mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial (Fig. 4a).

En total, 23 (37%) cepas de deleción mostraron una capacidad significativamente menor para proteger las células flanqueantes de una pérdida citoplasmática excesiva al lesionarse en comparación con el control de tipo salvaje (Fig. 4b), lo que indica una obstrucción de los poros septales deteriorada. En particular, la eliminación de sppA no impidió la pérdida citoplasmática (Fig. 4b). Esta incapacidad posiblemente sea causada por un defecto en la formación del tabique, ya que SppA-EGFP apareció transitoriamente en el sitio de formación del tabique, similar al ensamblaje y constricción del anillo de actina contráctil (Fig. 4c). SppA, que posee el dominio C2, es el ortólogo de Inn1 y Fic1 en levaduras en gemación y fisión, respectivamente (Figura complementaria 8a), las cuales son esenciales para el ingreso a la membrana plasmática durante la citocinesis29,30. Debido a que la formación del tabique en Pezizomycotina es análoga a la citocinesis, evaluamos la morfología del tabique en ΔsppA. Los controles de tipo salvaje exhibieron paredes en forma de disco que compartimentan las hifas (Fig. 4d). Por el contrario, ΔsppA mostró septos anormales con ingreso incompleto de la membrana plasmática desde la corteza (Fig. 4d). Un volumen mayor de componentes citoplasmáticos de células continuamente interconectadas se filtró en ΔsppA tras la herida de las hifas (Fig. 4e). Además, los cuerpos de Woronin estaban atados de manera anormal al tabique incompleto en la corteza hifal en ΔsppA (Fig. 4f).

La ausencia de SppB, SppC, SppD, SppE y SppF aumentó la pérdida citoplasmática a través del poro septal en relación con la cepa de tipo salvaje (Fig. 4b), lo que indica la relevancia funcional de estas proteínas en el taponamiento del poro septal al momento de la herida. La expresión de las proteínas de fusión de EGFP atenuó el defecto de obstrucción de los poros septales de las eliminaciones de genes correspondientes (Figura complementaria 6b), lo que confirma que las fusiones son funcionales. Luego visualizamos los cuerpos de Woronin en los fondos de eliminación de genes y descubrimos que permanecían atados al tabique (Figura complementaria 5b), lo que sugiere que su unión ocurre independientemente de las proteínas SPP. Sin embargo, más de la mitad de las 62 proteínas analizadas no parecían desempeñar un papel significativo en la obstrucción de los poros septales tras una herida.

Para investigar las relaciones funcionales entre las proteínas SPP, generamos cepas de doble deleción. Se seleccionaron los genes representativos sppG, sppF y sppE de categorías de localización; alrededor del poro septal, en ambos lados del tabique, y acumulación de poro septal, respectivamente. Los genes representativos seleccionados se eliminaron en el fondo de eliminación de otro gen en la misma categoría de localización. Después de la herida de las hifas, ninguna de las eliminaciones dobles, excepto ΔsppGΔsppA, mostró una reducción adicional en la obstrucción de los poros septales en comparación con la eliminación única (Figura complementaria 6c). Además, las eliminaciones simples revelaron un fenotipo mensurable, mientras que las eliminaciones dobles correspondientes no mostraron más deficiencias en la obstrucción de los poros septales. Estos resultados sugirieron que cada proteína SPP desempeñaba un papel no superpuesto y no podía sustituirse completamente entre sí.

Debido a que el poro septal se cierra bajo estrés10,11, 62 cepas que expresaban las proteínas localizadoras del tabique marcadas con EGFP fueron sometidas a estrés por frío (4 °C) para evaluar su comportamiento dinámico en el poro septal. Curiosamente, se observaron cuatro proteínas SPP que normalmente se localizaban en el citoplasma en el poro septal bajo estrés por frío (Fig. 5a). SppB, SppE y SppN se acumularon en el poro septal de ambas células flanqueantes, mientras que SppC estaba presente como puntos en el centro del poro septal (Fig. 5a). La localización de SppJ en el poro septal fue promovida por el estrés por frío (Fig. 5a).

a Localización de proteínas de fusión SPP-EGFP. Las flechas blancas y negras indican septos y las puntas de flecha rosadas indican acumulación de poros septales. Se muestran imágenes de fluorescencia confocales individuales. Barras de escala, 5 μm. b Modelos para fotoactivación y transferencia de célula a célula de Dendra2 (izquierda); cuantificación de la transferencia (derecha). Barras de escala, 10 μm. La transferencia de Dendra2 a través del poro septal se monitorizó en diez septos apicales elegidos al azar en cada experimento. Se realizaron tres experimentos independientes y el porcentaje de poro septal abierto se muestra en el eje Y. Los datos se presentan como la media de experimentos repetidos y las barras de error representan desviaciones estándar. La significación estadística se probó mediante la prueba t de Student de dos colas: *P < 0,05, **P < 0,01. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El estado de la conectividad de célula a célula en los fondos de deleción de genes que carecen de 62 proteínas septales se monitoreó bajo estrés por frío mediante el seguimiento de la transferencia de célula a célula de Dendra2, una proteína fluorescente fotoconvertible de verde a rojo10 (Fig. 5b, izquierda). ). En los controles de tipo salvaje, la fluorescencia roja del Dendra2 fotoconvertido se transfirió a las células adyacentes a través del poro septal, pero esta transferencia disminuyó drásticamente a 4 °C (Fig. 5b, derecha). Por el contrario, la difusión de Dendra2 no estuvo restringida en absoluto en ΔsppA tanto en temperaturas normales como frías (Fig. 5b, derecha), lo que indica una conectividad continua de célula a célula causada por la formación incompleta del tabique (Fig. 4d). Las cepas ΔsppB, ΔsppE y ΔsppC aún permitieron la transferencia de Dendra2 a baja temperatura (Fig. 5b, derecha), lo que indica una regulación parcialmente aberrante de la función del poro septal ante el estrés por frío.

Una gran cantidad de proteínas septales, incluidas las proteínas SPP, están asociadas con un pequeño sitio subcelular, el poro septal. A continuación, dilucidamos si las proteínas SPP poseen secuencias especializadas o características estructurales que las dirigen mecánicamente al tabique, como se informa con la región desordenada de las proteínas SPA de N. crassa17. Primero, analizamos el grado y la distribución de las regiones desordenadas presentes en las proteínas SPP utilizando IUPred2A31. Trece de las 23 proteínas SPP poseen secuencias con una alta probabilidad de trastorno intrínseco (Fig. 6 y Fig. complementaria 7a, b). Por lo general, las proteínas SPP que se localizaban en ambos lados del tabique estaban ordenadas estructuralmente, mientras que las que se localizaban alrededor del poro septal o se acumulaban en él estaban en su mayoría desordenadas (Fig. 6 y Fig. Suplementaria 7b). Para investigar la importancia de la región desordenada en la localización septal, expresamos variantes truncadas etiquetadas con EGFP. Curiosamente, los extremos N desordenados de SppB y SppD fueron suficientes y esenciales para la acumulación del tabique tras la herida (Fig. 6a). Las regiones desordenadas que contienen dominios ricos en prolina son importantes para la agregación de proteínas en el comportamiento de separación de fases32,33. Además de SppB, la secuencia de SppN era propensa a tener regiones desordenadas en toda su longitud y contenía motivos conservados ricos en prolina en los residuos N-terminales 1 a 265 (Figura complementaria 7c, d), que eran suficientes y necesarios para la inducción de heridas. acumulación septal (Fig. 6a). Por el contrario, en SppP, SppI, SppL y SppW, tanto las regiones ordenadas como las desordenadas fueron esenciales para su localización septal normal (Fig. 6b). En conjunto, la región desordenada es importante para la acumulación septal inducida por la herida y la localización septal normal.

a Tres proteínas SPP que muestran acumulación de poros septales tras la herida de las hifas albergaban una longitud considerable de una región desordenada separada de la región ordenada. b Cuatro proteínas SPP localizadas alrededor del poro septal y albergaban una longitud considerable de la región desordenada separada de la región ordenada. Los gráficos muestran la predicción de regiones desordenadas utilizando IUPred2A; el eje Y indica la probabilidad prevista de trastorno y el eje X representa la secuencia de aminoácidos. En el análisis microscópico de fluorescencia, se expresaron variantes completas y truncadas de proteínas SPP fusionadas con EGFP en el fondo de deleción correspondiente. Las cepas se cultivaron en medio CD suplementado con casaminoácidos al 1% durante 18 h. Se muestran imágenes de fluorescencia confocales individuales. Las flechas indican septos apicales y las puntas de flecha rojas indican acumulación de poros septales. Barras de escala, 5 μm. O ordenado, HACER desordenado.

A continuación, analizamos las regiones desordenadas en términos de composición de aminoácidos y las comparamos con las de las proteínas SPA de N. crassa y las proteínas/regiones desordenadas del conjunto de datos DisProt, así como las proteínas desordenadas de la repetición de fenilalanina/glicina (FG). nucleoporinas (FG-Nups) y factores de empalme repetidos de serina/arginina (SR). Las regiones desordenadas de las proteínas SPP y SPA revelaron sesgos hacia la arginina y la histidina, pero mostraron antipatías hacia la lisina y la glicina en comparación con las nucleoporinas FG, los factores de empalme SR y las proteínas/regiones desordenadas del conjunto de datos de Disprot (Figura complementaria 7e).

Analizamos la distribución filogenética y el grado de divergencia de las proteínas SPP en comparación con datos amplios de secuencias de proteínas recuperadas de especies representativas que cubren todos los principales filos y subfilos de hongos. En consecuencia, seleccionamos especies de subfilos dentro de Ascomycota (Taphrinomycotina, Saccharomycotina y Pezizomycotina) y Basidiomycota (Agaricomycotina, Pucciniomycotina y Ustilaginomycotina), así como representantes de linajes divergentes tempranos, Mucoromycota, Zoopagomycota, Chytridiomycota, Blastocladiomycota y Cryptomycota (Rozellomyco). ta) 20,34. Debido a su alta tasa de evolución35, los Microsporidia fueron excluidos de este análisis. En primer lugar, los datos del proteoma de 81 especies de hongos se clasificaron en grupos ortólogos utilizando OrthoFinder36. Posteriormente, las tasas de sustitución de proteínas ortólogas en filos/subfilos de hongos de la raíz de Pezizomycotina se calcularon en función de árboles filogenéticos de máxima probabilidad (Fig. 7 y Datos complementarios 5a-c). Para verificar aún más las relaciones ortólogas, se generaron filogenias de proteínas SPP para cada grupo ortólogo (Figuras complementarias S8 y 9). Junto con los análisis filogenéticos, las proteínas SPP finalmente se clasificaron en dos grupos evolutivos; (1) aquellos con ortólogos fuera de Pezizomycotina, y (2) aquellos presentes específicamente en Pezizomycotina (Fig. 7).

Las sustituciones de aminoácidos por sitio se muestran en azul como un mapa de calor. Los colores rellenos y vacíos denotan la presencia y ausencia de proteínas ortólogas, respectivamente, según los resultados de OrthoFinder. El árbol filogenético se generó utilizando el grupo de proteínas ortólogas con un único ortólogo presente en casi todas las especies. La escala de la izquierda de los modelos de estructuras de proteínas SPP representa el número de aminoácidos. ND sin dominio.

Trece proteínas (SppA, SppC, SppR, SppD, SppJ, SppU, SppE, SppH, SppP, SppL, SppV, SppB y SppK) exhibieron ortólogos fuera de Pezizomycotina. Entre ellos, SppA, SppC y SppR poseían ortólogos en levaduras ascomicetas que carecen de poros septales, Saccharomycotina y Taphrinomycotina, en el mismo clado. SppA contiene el dominio C2 (PF00168)37 y pertenece a un amplio grupo ortólogo que incluye Inn1 y Fic1 de levaduras en gemación y fisión, respectivamente (Fig. 7 y Fig. complementaria 8a). SppC posee un dominio CUE N-terminal (PF02845) 38, un SMR C-terminal (PF01713) 39 y DUF1771 (SM001162) 40. Al igual que SppA, SppC pertenece a un amplio grupo ortólogo (Fig. 7 y Fig. complementaria 8b). SppR se agrupó con la proteína de membrana peroxisomal Pex8 de algunas especies de hongos (Fig. 7 y Fig. complementaria 8c).

SppD, SppJ y SppU exhibieron múltiples subclados, incluido Pezizomycotina, dentro de sus grupos ortólogos. SppD posee tres repeticiones del dominio SEL1 (SM00671) 41 y forma un subclado específico de Pezizomycotina dentro del clado grande que incluye otras proteínas ortólogas de hongos (Fig. 7 y Fig. Suplementaria 8d). SppJ contiene un dominio DnaJ (PF00226)42 y forma un subclado específico de Pezizomycotina cerca de algunas especies de Chytridiomycota y Mucoromycota (Fig. 7 y Fig. complementaria 8e). SppU contiene un dominio similar a FMO (PF00743) 43 y forma un subclado que incluye Pezizomycotina y un número limitado de especies de Ustilaginomycotina, Taphrinomycotina y Chytridiomycota (Fig. 7 y Fig. complementaria 8f).

Además, las proteínas SppE, SppH, SppP, SppL y SppV exhibieron relaciones ortólogas con otros filos/subfilos de hongos, incluidas las levaduras ascomicetas Taphrinomycotina. SppE contiene un dominio de senescencia relacionado con las plantas (PF06911)44 y pertenece a un grupo ortólogo, que incluye Basidiomycota, hongos divergentes tempranas y Taphrinomycotina (Fig. 7 y Fig. complementaria 8g). SppH y SppP, que no poseen dominios conocidos, compartieron relaciones ortólogas con proteínas de hongos divergentes tempranos y algunas especies de Taphrinomycotina (Fig. 7 y Fig. complementaria 8h, i). SppL y SppV, este último albergando un dominio Aim21 (PF11489) 45, exhibieron relaciones ortólogas con un número limitado de especies de Taphrinomycotina (Fig. 7 y Fig. Suplementaria 8j, k).

SppB y SppK también exhibieron ortólogos fuera de Pezizomycotina, pero no en ninguna de las levaduras ascomicetas. SppB, que contiene un dominio Transglut_core (PF01841)46, pertenecía a un grupo ortólogo que incluye algunas especies de Chytridiomycota, Mucoromycota y Agaricomycotina (Fig. 7 y Fig. complementaria 8l). SppK mostró una relación ortóloga solo con algunas especies de Agaricomycotina (Fig. 7 y Fig. complementaria 8m).

Al igual que el otro grupo, se identificaron un total de diez proteínas SPP como existencias específicas de Pezizomycotina. Nueve proteínas SPP, incluidas SppF, SppG, SppI, SppM, SppN, SppO, SppS, SppT y SppW, no albergan ningún dominio pero carecen de relaciones ortólogas con otros filos y subfilos de hongos (Fig. 7 y Fig. complementaria 9a-i). ). SppQ contiene un dominio 14-3-3 (PF00244)47 y pertenece a un grupo ortólogo que incluye únicamente especies de Pezizomycotina, que es distinto de otro grupo que contiene el mismo dominio (Fig. 7 y Fig. complementaria 9j). Estas proteínas SPP se conservan comúnmente dentro de Pezizomycotina con las excepciones de SppN y SppS (Fig. 7).

A pesar de nuestro análisis bioinformático para seleccionar genes ausentes o divergentes en levaduras ascomicetas (Fig. 1b), dos proteínas SPP, SppA y SppC, contienen respectivos ortólogos de levadura dentro de los mismos clados (Fig. 8a, b complementaria). Por lo tanto, estas proteínas se analizaron funcionalmente en función de sus diferencias estructurales.

SppA posee un dominio C2 N-terminal, que se conserva en las proteínas ortólogas de los hongos. Sin embargo, la longitud del extremo C varía entre las proteínas ortólogas y es más larga en las especies de Pezizomycotina que en las levaduras ascomicetas y otros hongos (Fig. 8a). Para dilucidar la importancia funcional de regiones individuales, se expresaron variantes truncadas de SppA como fusiones de EGFP en el fondo de ΔsppA. Sus niveles de expresión fueron similares a los de SppA de longitud completa (Figura complementaria 10a, izquierda). Una variante de SppA (residuos 128 a 912) que carece de la región N-terminal junto con el dominio C2 no pudo completar la formación del tabique ni prevenir la pérdida citoplasmática excesiva tras la herida de las hifas (Fig. 8b, d). Además, esta variante no se localizó en el tabique (Figura complementaria 10b), lo que coincide con la función conocida de direccionamiento de la membrana por parte del dominio C237. De manera similar, los truncamientos de SppA que carecen del extremo C (residuos 1–127 y 1–476) no lograron atenuar el fenotipo defectuoso del poro del tabique causado por la eliminación de sppA (Fig. 8b, d), lo que indica el requisito de estas regiones para la formación adecuada del tabique. y taponamiento de los poros septales. A continuación, fusionamos la región N-terminal de SppA junto con el dominio C2 de A. oryzae y la región C-terminal de A. nidulans y N. crassa que contienen poros septales, así como de S. pombe que carece de poros septales. (Figura 8c). Las fusiones de EGFP de estas construcciones quiméricas se expresaron de manera similar a la SppA de longitud completa (Figura complementaria 10a, izquierda). Las proteínas quiméricas que contienen los extremos C de A. nidulans [SppA (AO + AN)] y N. crassa [SppA (AO + NC)] rescataron los fenotipos defectuosos del poro septal completa y parcialmente, respectivamente (Fig. 8c, d) . Por el contrario, la construcción con el extremo C del ortólogo Fic1 de S. pombe [SppA (AO + SP)] exhibió un defecto similar al de ΔsppA (Fig. 8c, d), lo que sugiere que la proteína de levadura no es completamente funcional. ortólogo de SppA. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la región C-terminal extendida de SppA proporcionó funciones relacionadas con el tabique, y la región se ha diversificado en el linaje que conduce a Pezizomycotina pero se acortó en las levaduras ascomicetas.

a, e Longitudes de SppA y SppC con sus ortólogos fúngicos. Los textos en rosa, azul, negro y verde indican especies de Pezizomycotina, levaduras ascomicetas, basidiomicetos y hongos de divergencia temprana, respectivamente. Las barras representan dominios proteicos conocidos. El número de residuos de aminoácidos se muestra en la escala en la parte superior. b Las regiones N-terminal y C-terminal extendida de SppA son esenciales para la formación normal del tabique. Los septos apicales se visualizaron utilizando colorante FM4-64. c Septos en cepas que expresan proteínas quiméricas SppA con el extremo N junto con el dominio C2 derivado de A. oryzae y el extremo C derivado de los ascomicetos que contienen o carecen de poros septales. AO Aspergillus oryzae, AN Aspergillus nidulans, NC Neurospora crassa, SP Schizosaccharomyces pombe. Los septos se visualizaron utilizando colorante FM4-64. SppA (AO + NC) rescató los fenotipos defectuosos en gran medida y se muestran las dos imágenes típicas de formación de tabique normal y anormal. Barras de escala, 5 μm. d, g Protección de las células flanqueantes contra la pérdida citoplasmática tras la herida de las hifas. En cada experimento se observaron treinta hifas seleccionadas al azar que mostraban estallido de la punta de las hifas. Se realizaron tres experimentos independientes y en el eje Y se muestra el porcentaje de hifas protegidas de la pérdida excesiva de citoplasma. Los datos se presentan como la media de experimentos repetidos y las barras de error representan desviaciones estándar. La significancia estadística se probó mediante la prueba t de Student de dos colas: **P < 0,01. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. f El extremo N de SppC es esencial para la acumulación en el poro septal tras la herida de las hifas. Se muestran imágenes de fluorescencia confocales individuales. Las flechas blancas indican septos y las puntas de flecha rojas representan la localización de los poros septales. Barras de escala, 5 μm.

SppC posee un dominio CUE N-terminal, que muestra diversidad de presencia o ausencia de dominio entre sus ortólogos (Fig. 8e y Fig. complementaria 8b). La alineación de secuencias múltiples reveló diversidad en los motivos MFP pero conservación del motivo LL (Figura complementaria 11), los cuales son necesarios para la unión de alta afinidad con la ubiquitina48,49. Para identificar las regiones responsables de la acumulación dirigida a los poros septales, los truncamientos de SppC se expresaron como fusiones de EGFP en el fondo de ΔsppC. Sus niveles de expresión fueron similares a los del SppC completo (Figura complementaria 10a, derecha). Los 185 residuos N-terminales que contienen el dominio CUE fueron suficientes para la acumulación en el poro septal al momento de la herida, similar a la proteína de longitud completa, mientras que el truncamiento de los 142 residuos N-terminales impidió esta respuesta (Fig. 8f). Sin embargo, solo los 142 residuos N-terminales sin el dominio CUE no se acumularon claramente en el poro septal (Fig. 8f), lo que indica que los 142 residuos N-terminales son esenciales pero no suficientes para acumularse en el poro septal. Una construcción N-terminal más larga (residuos 1 a 185) que contiene el dominio CUE rescató por completo el fenotipo defectuoso del poro septal de ΔsppC (Fig. 8g). Otras dos variantes truncadas de SppC (residuos 143–556 y Δ143–185 sin dominio CUE) no rescataron el fenotipo defectuoso (Fig. 8g). En conjunto, estos resultados indicaron que un extremo N completo que incluye el dominio CUE era esencial para la función de SppC relacionada con el poro septal.

En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de que las características específicas de Pezizomycotina, como el extremo C extendido de SppA y la región N-terminal de SppC, son importantes para la función septal.

En este estudio, comparamos dos grupos de hongos morfológicamente diversos para comprender mejor las innovaciones genéticas que conducen a la evolución del poro septal del hongo y su regulación. El cribado de localización identificó numerosas proteínas septales funcionalmente importantes que estaban ausentes o divergían en las levaduras que carecían de poros septales. Nuestros hallazgos muestran que Pezizomycotina ha desarrollado al menos 23 proteínas SPP, que se clasifican como aquellas con ortólogos fuera de Pezizomycotina o como aquellas presentes específicamente en Pezizomycotina, para la regulación de los poros septales contra condiciones adversas como heridas y estrés por frío.

Aunque anteriormente se han utilizado exámenes de localización a gran escala como un poderoso enfoque de genética inversa en animales50, levaduras25,26 y bacterias51, empleamos esta estrategia en hongos filamentosos por primera vez en el presente estudio. Las proteínas que se localizan en la punta de las hifas se encontraron con menos frecuencia que las que se localizan en el tabique (Fig. 2b y Fig. Suplementaria 3b). Esto podría deberse a que algunas levaduras ascomicetas, incluidas las especies utilizadas para nuestro cribado basado en bioinformática (Fig. 1b), pueden experimentar un crecimiento pseudohifal o hifal52. Por lo tanto, Pezizomycotina no ha desarrollado muchas proteínas que funcionen específicamente en el crecimiento de la punta de las hifas. Cinco de las proteínas de la punta de las hifas también se localizaron en el tabique/poro septal (Fig. 2b y Fig. complementaria 3b), similar a varias proteínas septales conocidas10,24. De estas, tres cepas de deleción que carecían de tales proteínas mostraron un crecimiento de colonias reducido en comparación con la cepa de tipo salvaje (Figura complementaria 6a; excepto SppA), lo que sugiere su participación en la morfogénesis de las hifas. La formación de septos perforados es evolutivamente específica y surgió únicamente en hongos multicelulares. Más de la mitad de nuestras proteínas septales identificadas (34/62) exhibieron localización alrededor del poro septal (Fig. 3a y Fig. Suplementaria 4a), lo que posiblemente contribuyó al mantenimiento de la estructura del poro septal.

Los hongos filamentosos han desarrollado sistemas de tratamiento de heridas con multicelularidad. Los subfilos septados Pezizomycotina y Agaricomycotina tienen el cuerpo de Woronin y la tapa del poro septal, respectivamente, para limitar la fuga citoplasmática tras la herida12,13,14. Por el contrario, el filo aseptado Mucoromycota exhibe gelificación protoplásmica53. En este estudio, el análisis cuantitativo de las hifas protegidas tras la herida reveló que más de un tercio (23/62) de las proteínas septales candidatas estaban involucradas en la obstrucción de los poros septales (Fig. 4b). Las eliminaciones dobles de los genes spp no ​​causaron más defectos en el taponamiento del poro septal (Fig. 6c complementaria), que no alcanzó el nivel de defecto severo en la eliminación de Aohex1 que codifica una proteína de la matriz corporal Woronin (Fig. 4b). Los cuerpos de Woronin, en los que la proteína Hex1 forma un núcleo cristalino denso más grande que el poro septal para resistir la presión de turgencia inducida por la herida54, desempeñan un papel principal en la función de obstrucción de los poros. Sin embargo, el taponamiento mediado por el cuerpo de Woronin puede requerir volver a sellar la membrana plasmática para completar el proceso de curación de la herida para la posterior reanudación del crecimiento. Una porción de las proteínas SPP, que se acumularon en el poro septal (Fig. 6a), exhiben características desordenadas con composiciones de aminoácidos comunes a las de las proteínas SPA de N. crassa (Fig. 7e complementaria). Las regiones desordenadas de las proteínas SPP fueron importantes en la acumulación septal tras la herida (Fig. 6a), y las características de agregación de las regiones desordenadas de las proteínas SPA de N. crassa sugieren una función para consolidar los cuerpos de Woronin con el poro septal17. Por lo tanto, estos aspectos en conjunto proponen que las proteínas SPP junto con las SPA de N. crassa desempeñan un papel secundario en la obstrucción de los poros septales.

Una caracterización adicional de los dominios funcionales presentes en varias proteínas SPP ayudará a abordar la evolución convergente de los componentes/mecanismos reguladores para la conectividad entre células, incluidas las uniones comunicantes, los plasmodesmos y los poros septales. SppA posee el dominio C2, que se ha implicado en el anclaje a los plasmodesmos55. El dominio CUE de SppC posee motivos MFP y LL de unión a ubiquitina conservados48,49 (Figura complementaria 11). La proteína de unión Cx43 sufre una degradación mediada por ubiquitina ante el estrés abiótico56, lo que sugiere que la ubiquitinación podría ser el proceso bioquímico compartido que regula la conectividad entre células en hongos y animales.

La conectividad entre células a través de uniones comunicantes56, plasmodesmos8 y poros septales10 puede bloquearse en respuesta al estrés tanto biótico como abiótico. En este estudio, el estado de la conectividad entre células se analizó cuantitativamente en respuesta al estrés por frío (Fig. 5b). Una cepa que carecía de SppA mostró una transferencia irrestricta de Dendra2 de célula a célula incluso bajo estrés por frío debido a una morfología defectuosa del tabique (Fig. 5b). Tres proteínas SPP (SppB, SppC y SppE) tuvieron una función en el taponamiento de los poros septales tanto bajo estrés por herida como por frío (Figs. 4b y 5b), lo que sugiere una maquinaria común de respuesta al estrés. En general, las proteínas SPP respondieron menos al estrés por frío que a la herida de las hifas (Figs. 4b y 5b), lo que sugiere su participación predominante en la protección de las células flanqueantes de la pérdida citoplasmática inducida por la herida.

Según el grupo ortólogo y los análisis filogenéticos, 13 proteínas SPP tienen ortólogos fuera de Pezizomycotina (Fig. 7). En particular, en las proteínas SPP con ortólogos de hongos divergentes tempranos, sus orígenes son anteriores a la aparición del poro septal, lo que sugiere la cooptación de los genes preexistentes para la regulación del poro septal. Nuestro cribado basado en bioinformática se diseñó originalmente para identificar genes que eran divergentes o estaban ausentes en las levaduras que carecían de poros septales (Fig. 1b). Contrariamente a nuestro objetivo, 12 proteínas SPP mostraron relaciones ortólogas con las de las especies carentes de poros septales de levaduras ascomicetas y hongos divergentes tempranas (Fig. 7 y Fig. complementaria 8). Este hallazgo plantea una cuestión fundamental sobre las funciones principales y generales de estas proteínas. SppA exhibe una extensión en el extremo C terminal en Pezizomycotina (Fig. 8a), que podría ser evolutivamente específica de la formación del tabique poroso. La citocinesis de la levadura es morfológicamente diferente a la de Pezizomycotina, ya que las células hijas de la levadura están completamente separadas de la madre por los ortólogos de SppA29,30. En este escenario, la incapacidad del mutante de deleción sppA para tapar el poro septal puede explicarse por una citocinesis o formación de tabique defectuosa. Nif1 y Dsf2 son ortólogos de SppD en levaduras de fisión y gemación, respectivamente (Figura complementaria 8d). Nif1 actúa como un inhibidor mitótico mediante la interacción con la proteína quinasa Nim157, mientras que Dsf2 se localiza en el cuello de la yema58, el sitio de la citocinesis. Esto sugiere un posible papel de SppD en la regulación del ciclo celular o la citocinesis. El subclado SppD es distinto de otro subclado que contiene Pezizomycotina y ortólogos de levadura (Figura complementaria 8d). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que SppD evolucionó en Pezizomycotina mediante duplicación de genes para realizar funciones relacionadas con los poros septales. Por tanto, el papel funcional de SppD en la formación de tabiques porosos requiere más investigación.

SppC posee una región N-terminal funcionalmente importante que contiene el dominio CUE, que muestra diversidad de presencia o ausencia de dominio entre sus ortólogos (Fig. 8e y Fig. complementaria 8b). La proteína Cue2, ortóloga de SppC en levaduras en ciernes, desempeña un papel en la unión de ubiquitina49. SppJ que contiene el dominio DnaJ exhibe una relación ortóloga con la levadura en ciernes Sis1 (Figura complementaria 8e), que participa en la degradación de proteínas citosólicas mal plegadas59. Sin embargo, aún queda por investigar la participación de la ubiquitinación y las respuestas de proteínas mal plegadas en la regulación de los poros septales. Por el contrario, SppB no posee ningún ortólogo en las levaduras ascomicetas (Fig. 7). El dominio transglutaminasa de SppB es conocido por sus propiedades de reticulación, que funcionan en la cicatrización de heridas en mamíferos y en la coagulación de la sangre tras una lesión46. Esta función es similar a la obstrucción del poro septal fúngico inducida por heridas.

En el reino de los hongos, se supone que la morfología de las hifas evolucionó en los primeros filos de hongos divergentes Blastocladiomycota, Chytridiomycota y Zoopagomycota20. El poro septal y su regulación parecen haber surgido de forma independiente en los subfilos Pezizomycotina y Agaricomycotina1. Por lo tanto, durante la transición evolutiva desde ancestros aseptados, se necesitaron muchos eventos evolutivos genéticos para modular la organización y regulación de los poros septales. Nuestro grupo ortólogo y los análisis filogenéticos (Fig. 7 y Fig. complementaria 9) demostraron que diez genes SPP están presentes específicamente en Pezizomycotina. De manera similar, se ha informado de la existencia específica dentro de Pezizomycotina de los genes relacionados con el cuerpo de Woronin para Hex1, su receptor de clasificación WSC, la correa del cuerpo de Woronin Leashin y varias proteínas SPA21. Se ha propuesto que dichos genes específicos de linaje surgieron de regiones ancestralmente no genéticas o por una divergencia excesiva después de un reordenamiento genómico como la recombinación, la retrotransposición y la transferencia horizontal de genes60,61. La existencia específica de Pezizomycotina de los diez SPP (Fig. 7 y Fig. 9 complementaria) y de los genes relacionados con el cuerpo de Woronin sugiere su aparición en un ancestro común de Pezizomycotina y su posterior adquisición mediante transferencia vertical para ayudar a las funciones relacionadas con los poros septales. Este fenómeno puede ser similar al subyacente a múltiples genes específicos de linaje presentes en levaduras y gusanos que están funcionalmente asociados con la segregación cromosómica62.

Nuestros hallazgos demuestran la efectividad de la selección basada en bioinformática para identificar muchas proteínas nuevas involucradas en la obstrucción de los poros septales de los hongos tras la herida de las hifas. Durante la evolución de la estructura septal, la organización celular interconectada podría haber sido vulnerable a amenazas ambientales y tensiones fisiológicas como heridas mecánicas10, propagación ininterrumpida de micovirus63 e incompatibilidad de heterocariones mediada por alorreconocimiento64. Tales condiciones adversas podrían imponer una presión de selección para la adaptación, ya sea mediante la cooptación de genes preexistentes o mediante la adquisición de nuevos genes para ayudar en la regulación de los poros septales.

Se recuperaron proteomas completos de siete especies de hongos de la base de datos del genoma FungiDB (//www.fungidb.org). Usamos 12090 proteínas de A. oryzae y consultamos cada una usando BLASTp. Se estableció como criterio de comparación genómica la presencia o ausencia del poro septal, como estructura morfológica especializada. Buscamos genes conservados en los ascomicetos que contienen poros septales A. oryzae, A. fumigatus y A. nidulans con valores de e menores o iguales a 1e-100; Luego buscamos genes ausentes o divergentes en las levaduras ascomicetas S. cerevisiae, S. pombe y C. albicans, con valores de e mayores o iguales a 1e-30. Este proceso produjo 2130 proteínas candidatas de poro septal en A. oryzae.

Seleccionamos preferentemente proteínas no caracterizadas, definidas como aquellas que carecen de datos biológicos para los términos GO con respecto a funciones moleculares, componentes celulares y procesos biológicos. En total, se identificaron 5878, 7868 y 5664 genes para funciones moleculares, componentes celulares y procesos biológicos, respectivamente. Finalmente se determinó como genes no caracterizados un total de 3498 genes que carecían de datos biológicos para los tres términos GO. Luego buscamos las 2130 proteínas candidatas antes mencionadas dentro de este subconjunto no caracterizado y seleccionamos 776 genes para la detección de localización.

Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en los Datos complementarios 3. A. oryzae se transformó como se describió anteriormente65. Se utilizó la cepa NSPlD1 de A. oryzae (niaD- sC- ΔpyrG ΔligD) 10 como cepa original. Usando el marcador seleccionable pyrG, los transformantes se seleccionaron usando medio M + Met [0,2% NH4Cl, 0,1% (NH4)2SO4, 0,05% KCl, 0,05% NaCl, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4·7H2O, 0,002% FeSO4·7H2O, 0,15% de metionina y 2% de glucosa; pH 5,5]. Los transformantes con los marcadores seleccionables niaD y sC se seleccionaron usando medio CD (0,3% NaNO3, 0,2% KCl, 0,1% KH2PO4, 0,05% MgSO4·7H2O, 0,002% FeSO4·7H2O y 2% glucosa; pH 5,5) y CD+Met. medio suplementado con 0,0015% de metionina, respectivamente. Las cepas de A. oryzae se mantuvieron en medio Potato Dextrose (PD) (Nissui, Tokio, Japón) a 30 °C. Para la transformación, las cepas se inocularon en medio líquido DPY (0,5% de extracto de levadura, 1% de hipolipeptona, 2% de dextrina, 0,5% de KH2PO4, 0,05% de MgSO4 · 7H2O, pH 5,5) y se cultivaron durante la noche. Para microscopía, se inocularon conidios en placas con base de vidrio que contenían 100 μl de medio líquido CD suplementado con casaminoácidos al 1%. Para la herida de hifas, se utilizó medio agar en lugar de medio líquido. Para una inducción y represión completa del promotor amyB, se incluyeron en medio CD 2% de dextrina y 2% de glicerol, respectivamente, como fuentes de carbono.

Las secuencias de ácidos nucleicos para las 776 proteínas candidatas del poro septal se recuperaron de la base de datos del genoma de Aspergillus AspGD (actualmente cerrada, pero el conjunto de datos está disponible en la base de datos FungiDB; https://fungidb.org/fungidb/app). El marco de lectura abierta que codifica cada proteína se amplificó a partir de ADN genómico RIB40 con ADN polimerasa PrimeSTAR® HS (TaKaRa Bio, Otsu, Japón) para PCR de alta fidelidad, utilizando los cebadores enumerados en los Datos complementarios 6. Luego, los fragmentos amplificados se fusionaron con pUt-C-EGFP10 linealizado con SmaI utilizando el kit de clonación In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, EE. UU.). Las secuencias genéticas fusionadas con el gen egfp se colocaron en tándem entre las secuencias enlazadoras. Los plásmidos recombinantes usados ​​para la expresión de proteínas fusionadas con EGFP se digirieron usando NotI y se insertaron en el locus niaD de la cepa NSlD110 de tipo salvaje mediante recombinación homóloga. Los transformantes se seleccionaron basándose en la asimilación de nitratos. Las cepas que expresan fusión de EGFP generadas para la detección de localización se enumeran en los Datos complementarios 3.

Los cebadores utilizados para generar las cepas de deleción se enumeran en los Datos complementarios 6. Los genes individuales con el marcador pyrG se reemplazaron amplificando las regiones de 1,5 kpb aguas arriba y aguas abajo de los genes utilizando los conjuntos de cebadores gene-upstream1_F/gene-upstream2_R y gene-downstream1_F. /gene-downstream2_R, respectivamente. El marcador pyrG se amplificó a partir de ADN genómico de RIB40 utilizando los cebadores PyrG_F y PyrG_R. Los tres fragmentos de ADN amplificados (regiones ascendentes y descendentes de los genes objetivo y pyrG) y el vector pUC19 linealizado se fusionaron utilizando el kit de clonación In-Fusion HD. Las construcciones de deleción se amplificaron adicionalmente usando el conjunto de cebadores gene-upstream1_F/gene-downstream2_R del plásmido resultante como plantilla, y luego se introdujeron en el locus nativo de la cepa NSPlD110 de A. oryzae mediante recombinación homóloga. Los transformantes se seleccionaron usando prototrofia de uridina/uracilo.

Las eliminaciones de sppG, sppF y sppE con el marcador sC se realizaron amplificando regiones ascendentes y descendentes de 1,5 kpb utilizando los conjuntos de cebadores gene_upstream1_F/gene-upstream2 (sC)_R y gene-downstream1(sC)_F/gene-downstream2_R, respectivamente. . El marcador sC se amplificó a partir de ADN genómico de RIB40 utilizando los cebadores sC_F y sC_R. Se fusionaron los tres fragmentos y el vector pUC19 linealizado. Se introdujeron construcciones de deleción amplificadas por PCR de sppG, sppF y sppE en los loci nativos de ΔsppA/ΔsppP/ΔsppI/ΔsppT/ΔsppW/ΔsppL/ΔsppS/ΔsppJ/ΔsppQ, ΔsppM/ΔsppH/ΔsppO/ΔsppU/ΔsppR, y ΔsppB/ ΔsppC/ΔsppD/ΔsppK/ΔsppN/ΔsppV, respectivamente.

Para analizar la conectividad entre células a través del poro septal bajo estrés por frío (Fig. 5), se utilizó Dendra2, una proteína fluorescente fotoconvertible de verde a rojo10. El plásmido pUt-NA-dendra210 que expresa Dendra2 se amplificó y se digirió utilizando NotI. Se insertó ADN precipitado con etanol en el locus niaD de cepas de deleción que carecían de 62 proteínas localizadoras del tabique mediante recombinación homóloga.

Para determinar la importancia de la región desordenada, se utilizaron fragmentos que codifican los residuos 1–264 y 265–697 de SppB; 1-145 y 146-390 de SppD; 1–265 y 265–1234 de SppN; 1–92, 93–509, 1–192 y 193–470 de SppI; 1–99 y 100–962 de SppL; y se amplificaron 1–167 y 168–465 de SppW. Para las variantes truncadas que carecen de la región N-terminal, se añadió un codón de inicio. Luego, el fragmento individual se fusionó con pUt-C-EGFP linealizado con SmaI. Los plásmidos recombinantes se digirieron con NotI y se insertaron en el locus niaD de los fondos de deleción correspondientes mediante recombinación homóloga.

Los cebadores utilizados para truncar SppA y SppC se enumeran en los Datos complementarios 6. Los fragmentos truncados amplificados se fusionaron con pUt-C-EGFP digerido con SmaI y luego se insertó un casete de expresión digerido con NotI en el locus niaD. Para generar proteínas quiméricas de SppA (Fig. 7), se amplificó un ADN que codifica el extremo N (residuos 1 a 127) a partir del ADN genómico de RIB40, y los de los extremos C de A. nidulans (residuos 126 a 810). N. crassa (residuos 127–863) y S. pombe (residuos 135–810) se amplificaron utilizando el ADN genómico de las cepas correspondientes FGSC_A26, OR74A y 972 h, respectivamente. Los fragmentos se fusionaron con pUt-C-EGFP10 digerido con SmaI utilizando el kit de clonación In-Fusion HD. Los plásmidos construidos se digirieron usando NotI y se insertaron en el locus niaD de ΔsppA mediante recombinación homóloga.

SppC fue truncado tanto desde el extremo C como desde el extremo N. Los fragmentos de ADN que codifican los residuos N-terminales 1–142 y 1–185 se amplificaron a partir del ADN genómico de RIB40. Se fusionaron con pUt-C-EGFP digerido por SmaI. Para truncar las regiones N-terminales que contienen el dominio CUE, se amplificó un fragmento de ADN que codifica los residuos 143–556 agregando un codón de inicio ATG. El fragmento y el pUt-C-EGFP digerido con SmaI se fusionaron utilizando el kit de clonación In-Fusion HD. Los plásmidos construidos se digirieron usando NotI y se usaron para insertar casetes de expresión en el locus niaD de ΔsppC mediante recombinación homóloga.

Se observaron septos apicales de hifas vivas que expresan proteínas marcadas con EGFP utilizando un microscopio invertido IX71 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con lentes objetivo Neofluar de 100 × (apertura numérica de 1,40); láseres semiconductores de 488 (Furukawa Electric, Tokio, Japón) y 561 nm (Melles Griot, Rochester, NY, EE. UU.); filtros GFP (Nippon Roper, Tokio, Japón); un sistema de escaneo confocal CSU22 (Yokogawa Electronics, Tokio, Japón); y una cámara CCD digital refrigerada Andor iXon (Andor Technology PLC, Belfast, Reino Unido). Las imágenes se analizaron utilizando el software Andor iQ 1.9 (Andor Technology PLC).

Las puntas de las hifas se reventaron inundando las colonias con 1 ml de agua después del crecimiento en una capa delgada de medio agar DPY en un plato con base de vidrio a 30 °C durante 18 h. Después de la inundación, la colonia se dejó durante 2 minutos antes de la observación. Se observaron treinta hifas seleccionadas al azar que mostraban puntas rotas mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial.

Para analizar la transferencia de Dendra2, las hifas se cultivaron en una capa delgada de medio CD (2% de dextrina como fuente de carbono) suplementado con 1% de casaminoácidos a 30 °C durante 17 h. El cultivo se incubó adicionalmente en condiciones normales o de estrés por frío (4 ° C, 30 min). Antes de la observación, las hifas se iluminaron con una lámpara UV de mercurio colocada al menos a 20 μm del tabique apical seleccionado para evitar la iluminación de la célula adyacente, como se describió anteriormente10. La transferencia de Dendra2 a través del poro septal se observó después de la fotoconversión con excitación de 553 nm10.

Se anotaron regiones desordenadas de proteínas SPP utilizando IUPred2A31. Para el análisis de la composición de aminoácidos, las secuencias de las proteínas SPA de N. crassa se recuperaron de la base de datos del genoma FungiDB. Como proteínas/regiones desordenadas, regiones desordenadas definidas por IUPred2A de proteínas SPP y SPA, proteínas desordenadas de factores de empalme ricos en serina/arginina (SR)66 y nucleoporinas con repeticiones de fenilalanina/glicina (FG)67, y proteínas/regiones desordenadas de la base de datos DisProt68 fueron usados. Las proteínas/regiones ordenadas se tomaron del conjunto de datos O_PDB_S2569. Se compararon las composiciones de aminoácidos de diferentes conjuntos de proteínas/regiones desordenadas para cada aminoácido de acuerdo con el método desarrollado previamente17,70. La diferencia fraccionaria se calculó como (PX - Porder)/Porder, donde PX representa el porcentaje de un aminoácido particular en el conjunto de proteínas/regiones desordenadas de consulta, y Porder denota el porcentaje correspondiente de proteínas/regiones ordenadas en el conjunto de datos O_PDB_S25.

Se analizaron veintitrés proteínas SPP utilizando herramientas de investigación de arquitectura modular simple (SMART: http://smart.embl-heide lberg.de/)71 para detectar dominios predichos. Para analizar la conservación de la secuencia primaria, se realizaron múltiples alineamientos de secuencia utilizando ClustalW72 y los resultados se presentaron utilizando el servidor BoxShade versión 3.21.

Para el análisis de grupos ortólogos, obtuvimos datos de proteomas fúngicos disponibles en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y el portal de hongos MycoCosm del Joint Genome Institute (JGI) (https ://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home) bases de datos. En total, se seleccionaron 81 especies de hongos para cubrir todos los clados principales de hongos de los subfilos de Ascomycota (Taphrinomycotina, Saccharomycotina y Pezizomycotina) y Basidiomycota (Agaricomycotina, Pucciniomycotina y Ustilaginomycotina), así como filos representativos de Mucoromycota, Zoopagomycota, Chytridiomycota. , Blastocladiomycota y Rozellomycota (Datos complementarios 5d). Los grupos ortólogos se analizaron utilizando OrthoFinder 2.3.1436 con los parámetros predeterminados.

Para el análisis de la tasa de sustitución, seguimos un método descrito previamente21. Se seleccionó una proteína representativa filogenéticamente cercana a las proteínas ortólogas de Pezizomycotina de cada especie de hongo (Datos complementarios 5b). Se construyeron múltiples alineamientos de secuencias para proteínas individuales utilizando ClustalW72 con penalizaciones de espacios unificados, incluidas penalizaciones por apertura de espacios y penalizaciones por extensión de espacios. Se generaron árboles de máxima probabilidad para cada proteína utilizando PhyML. Los árboles filogenéticos se confirmaron construyéndolos con una herramienta diferente, Molecular Evolutionary Genetics Tool, MEGA 773. Se calculó la tasa de sustitución para una especie determinada, x, en el árbol correspondiente, y la distancia evolutiva entre las secuencias de proteínas y las secuencias ancestrales de Pezizomycotina de A. Las proteínas SPP de . oryzae se estimaron mediante la puntuación \(s\left(x\right)=d\left(x\right)-\frac{{\sum }_{y\in {Pezizomycotina}}d(y)} {P}\) (unidad: sustituciones/sitio), donde d(x) indica la longitud de la rama desde la especie x hasta la raíz de Pezizomycotina. P representa el número de especies y en Pezizomycotina utilizadas en el análisis filogenético y, por lo tanto, \(\frac{{\sum }_{y\in {Pezizomycotina}}d(y)}{P}\) representa la longitud promedio de las ramas de cada especie y en Pezizomycotina a la raíz de Pezizomycotina.

Para dilucidar aún más las relaciones ortólogas, se generaron árboles filogenéticos utilizando todas las proteínas clasificadas en el mismo grupo ortólogo. Se realizaron múltiples alineamientos de secuencias y se construyeron árboles filogenéticos sin raíces para las proteínas analizadas utilizando MEGA 773.

Las cepas se cultivaron en medio DPY durante 18 h. Los micelios de los hongos se congelaron en nitrógeno líquido y posteriormente se trituraron utilizando un impactador de múltiples perlas. Después de la extracción, los lisados ​​celulares se incubaron con un tampón que contenía detergente NP-40 [Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 200 mM, PMSF 1 mM/ml, cóctel inhibidor de proteasa 1X (Sigma, St. Louis, MO, USA: P8215), 1% NP-40] para solubilizar las proteínas de membrana. El extracto micelial solubilizado con el tampón se incubó en hielo durante 20 min. Después de centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos, se recogió el sobrenadante. Los lisados ​​​​celulares se separaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) Immobilon-P (Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU.) utilizando un sistema de transferencia semiseca (Nihon Eido, Tokio, Japón). Para detectar EGFP, se utilizan el anticuerpo monoclonal Living Colors® AV (anti-GFP) (dilución 1: 2000, n.º de cat. 632380, Clontech) y el anticuerpo IgG anti-ratón (H + L) marcado con peroxidasa (dilución 1: 2000, n.º de cat. PI -2000, Vector Laboratories, Newark, CA, EE. UU.) se utilizaron como anticuerpos primarios y secundarios, respectivamente. La quimioluminiscencia se detectó utilizando un sistema Western Lightning-ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.) y un analizador de imágenes LAS-4000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

Los resultados de al menos tres experimentos independientes se presentan como medias. Las barras de error representan desviaciones estándar como se indica en las leyendas de las figuras. La significancia estadística se probó mediante la prueba t de Student de dos colas en Microsoft Excel; la significancia se indica como *P < 0,05 o **P < 0,01.

Cuando se muestran imágenes representativas (Figs. 2b; 3a – c; 4a, c – f; 5a; 6a, b; 8b, c, f; y Figs. complementarias 1, 2, 3a, b, 4a – e, 5a, b, 10a, b), se observaron tres hifas independientes y se muestra una imagen representativa.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos del presente estudio están disponibles en este documento, Información complementaria y Datos fuente. Las secuencias genéticas de A. oryzae se pueden encontrar en FungiDB (https://fungidb.org/fungidb/app), y las secuencias de ortólogos de hongos se pueden encontrar en NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /). Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Este estudio fue apoyado por la subvención KAKENHI número 21H02098 (JM) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), la subvención para investigación científica (B) y la subvención 21F21099 (JM), para Becarios JSPS. SN contó con el apoyo del Programa de investigación de máxima prioridad de la Universidad de Toyo. Agradecemos al Dr. Kensuke Seto (Facultad de Ciencias del Medio Ambiente y la Información, Universidad Nacional de Yokohama, Kanagawa, Japón) por la lectura crítica del manuscrito. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Departamento de Biotecnología, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Maryland. Abdulla Al Mamun y Jun-ichi Maruyama

Centro de Investigación de Tecnología de la Información Agrícola, Organización Nacional de Investigación Agrícola y Alimentaria (NARO), Tsukuba, Ibaraki, Japón

wei cao

Departamento de Redes de Información para la Innovación y el Diseño, Facultad de Redes de Información para la Innovación y el Diseño, Universidad de Toyo, Tokio, Japón

Shugo Nakamura

Instituto de Investigación Colaborativa para Microbiología Innovadora, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Jun-ichi Maruyama

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MAAM y JM concibieron y diseñaron el estudio. MAAM realizó experimentos y MAAM y JM interpretaron los resultados. SN y WC llevaron a cabo la búsqueda BLAST a gran escala e interpretaron los datos. JM realizó análisis filogenéticos y de grupos ortólogos, y todos los autores interpretaron los datos. MAAM y JM escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Jun-ichi Maruyama.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a László Nagy y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mamun, MAA, Cao, W., Nakamura, S. et al. Identificación a gran escala de genes implicados en la obstrucción de los poros septales en hongos multicelulares. Nat Comuna 14, 1418 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36925-y

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Recibido: 20 de enero de 2022

Aceptado: 23 de febrero de 2023

Publicado: 17 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36925-y

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